大家好，我是小燕同学，今天为大家分享一篇关于“TNF拮抗剂促使CIA小鼠滑膜成纤维细胞对ferroptosis敏感”研究的文章，题目为“TNF antagonist sensitizes synovial fibroblasts to ferroptotic cell death in collagen-induced arthritis mouse models”，于2022年2月发表在NATURE COMMUNICATIONS上。文章的通讯作者是第四军医大学西京医院临床免疫科学术带头人、主任医师、博士研究生导师朱平教授，围绕类风湿关节炎等风湿免疫性疾病的免疫介导机制和诊断治疗新技术研究做了大量工作。该论文的研究情况介绍如下：
【话题→主题→科学问题】
1. 类风湿性关节炎（RA）与炎症之间的关系
RA是一种自身免疫性炎症疾病。
RA病理表现之一是关节组织滑膜增生，导致关节破坏。
RA中关节滑膜成纤维细胞（RA-FLS）异常增生，产生促炎因子、基质降解酶，导致炎症、增生及骨降解。
2. 炎症（免疫）与铁死亡之间的联系（通过激活或抑制铁死亡可以干预疾病的发展）
铁死亡（ferroptosis）在机体代谢紊乱、细胞铁离子条件下，促使脂质过氧化物、ROS积累，进而触发细胞的铁死亡过程。谷胱甘肽的耗竭，GPX4活性下降，脂质氧化物不能通过GPX4催化的谷胱甘肽还原酶反应代谢，之后二价的铁离子可以氧化脂质产生活性氧，从而促使铁死亡的发生。
• GSH、GPX4下调，脂质过氧化物、ROS、铁离子上调
• GSH
• GSH：由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成，半胱氨酸为限速物质
• 降低（消耗GSH）的策略：①切断GSH合成的原料供应；②抑制GSH的合成或再生；③消耗GSH储备；④促进GSH的外排
• GSH、脂质过氧化物为GPX4的共同底物
• ROS疗法（靶向递送特定物质到特定组织，经光、超声或化学刺激、激活产生大量的ROS，引发细胞死亡。
• PDT、SDT、CDT疗法
众多研究已证实，铁死亡参与动物先天性免疫，包括调控炎症损伤、信号转导和细胞生长过程。
但是，炎症过程与铁死亡之间的具体联系是怎样的，尚属未知。
3. RA与ROS、铁死亡之间的关系
RA进程中，大量的ROS产生，进而引起细胞氧化应激损伤，但RA-FLS在炎症微环境的氧化压力条件下，依然异常增殖，表明其可免受生理性铁死亡的微环境压力。
RA中，ROS产生→氧化应激损伤耐受→逃脱生理性铁死亡
最终，RA-FLS耐受氧化应激而异常增生的原因是什么？是否打破其耐受途径--铁死亡能否控制RA的病程？若能，其具体机制是什么？
【研究思路-结果】
1. 表型观察与验证：以OA为对照（OA为关节退行性病变，RA为增生性），确定类风湿性关节炎患者的增生性滑膜和滑液中脂质过氧化物积累和铁超载。（是否具备铁死亡特点）
脂质氧化、过氧化过程相关预测生物标志物（8-OHdG、4-HNE、MDA）--滑膜组织
• HE、IHC、组织免疫荧光（基于酪酰胺信号放大（TSA）的免疫荧光复合物观察）
2. RA-FLS对IKE诱导的铁死亡敏感。
arthritis score、paw thickness、micro-CT、组织染色（H&E,toluidine blue O, and safranin O staining）
分组：40mg/kg IKE every day and/or 10mg/kg liproxstain-1 (Lip-1)every 2days for 22 days. n=9 mice for CIA +Vehicle and CIA+IKE group, n=8 mice forCIA+Lip-1 and CIA+IKE+Lip-1 group
PTGS2（IKE诱导剂标志物）、GPX4（氧化压力及铁死亡标志物）
FAPα（成纤维细胞激活蛋白，RA-FLS标志物）--滑膜组织
3. RA-FLS的亚群在关节炎模型滑膜中具有明显的铁死亡易感性和功能多样性，且铁死亡耐受的RA-FLS亚群中TNF信号途径富集程度最高。
RA滑膜组织单细胞转录组测序
• tSNE plot（特征细胞群体可视化）→确定对铁死亡耐受/易感的成纤维滑膜细胞
• Heatmap plot（RA-FLS细胞群体中高风险铁死亡基因表达情况）
• 确定铁死亡耐受/易感的成纤维滑膜细胞中保守基因表达情况
• Violin plot
• MFI（多重免疫荧光）
• 铁死亡耐受/易感的成纤维滑膜细胞之间的GSEA富集分析
4. RA疾病中以TNFRSF1A、TNFRSF1B为媒介，通过TNF信号途径实现巨噬细胞与滑膜成纤维细胞亚群之间的信号传导。
以tSNE、基因表达上下调为分类依据，确定RA-FLS的铁死亡耐受/易感细胞
巨噬细胞分别与RA-FLS的铁死亡耐受/易感细胞之间的分子互作分析
RA的关键细胞因子传导角度考虑
• TNF促使RA-FLS免受铁死亡
• 促炎因子IL-6、TGF-β促进RA-FLS发生铁死亡
5. TNF促使RA-FLS免受铁死亡的分子机制：TNF通过NF-kB信号途径促进RA-FLS细胞中GSH合成原料--半胱氨酸的摄取，提高GSH水平，进而抑制细胞脂质过氧化，使细胞逃脱铁死亡。
• TNF干预RA-FLS细胞，探究铁死亡相关信号途径Cys-Cys/Cys/GSH/GPX4轴关键基因表达、脂质ROS生成情况
→TNF促进GSH的生成
• GSH生成途径关键基因表达分析
• GSH下游效应蛋白或通路分析
【特色与创新点】
• 本文发现了促炎因子TNF参与细胞生物过程的新功能，即促进Cys摄入、GSH合成，抑制胞内氧化反应，阻止滑膜增生成纤维细胞中铁死亡的发生。
• 增加了铁死亡诱导剂、TNF抑制剂的应用价值。
• RA滑膜组织细胞分型及采用单细胞转录组测序对滑膜组织成纤维细胞亚群进行鉴定、机制研究——热门技术。
