01一、文章信息
发表杂志名称：Journal of Translation Medicine
中文标题：多转录组学揭示胶质母细胞瘤中生态位特异性表达程序和内皮细胞特征
英文标题：Multi-transcriptomics reveals niche-specific expression programs and endothelial cells in glioblastoma
影响因子：7.5
发表日期：2025 年 4 月 15 日
01二、研究概述
胶质母细胞瘤（GBM）是一种高致死性颅内恶性肿瘤，以坏死周围假栅栏状细胞（PAN）和微血管增生（MVP）为组织病理学特征，但其分子和细胞成分的空间组织尚未完全阐明。作者通过整合胶质母细胞瘤患者的批量 RNA 测序、空间转录组和单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据，识别出生态位特异性转录程序，表征了 PAN 和 MVP 在分子表达及细胞组织上的差异。研究发现肿瘤核心内存在空间上不同的区域，NDRG1 和 EPAS1 分别在 PAN 和 MVP 区域特异性表达，且两种不同表型的内皮细胞（ECs）分别在 MVP 和 PAN 区域富集，PAN 相关内皮细胞具有与 GBM 细胞相似的拷贝数变异，单细胞轨迹分析显示胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）向 ECs 分化的假时间轨迹。这些发现为理解 GBM 进展提供了细胞和分子层面的见解。
01三、研究结果
（一）图 1：通过不同分子谱表征胶质母细胞瘤肿瘤内表达异质性
作者首先构建了整合多层次 RNA 测序数据的分析流程，涉及 41 个 RNA-seq 数据集、28 个空间转录组（SRT）数据集和 28 个 scRNA-seq 数据集（GSE131928）。随后，在 Ivy-GAP 数据集中，对 270 个激光显微切割的 GBM 组织样本（涵盖皮质区 CT、增生血管区 HBV、PAN、MVP 等多个区域）进行分析，比较血管周围区域（HBV 和 MVP）与 CT、坏死周围区域（PNZ 和 PAN）与 CT 的表达谱，发现 PAN 和 PNZ、HBV 和 MVP 分别具有相似的表达谱，PAN 和 PNZ 中促血管生成基因（如 IL-8、VEGFA、NDRG1）表达升高，HBV 和 MVP 中内皮细胞和干性相关基因（如 ESM1、CRIP1）表达较高，且 MVP 中肿瘤发生和迁移相关分子（如 HIGD1B、MMP9）表达增加，同时鉴定出 PAN 中 312 个特异性上调基因和 MVP 中 1048 个特异性上调基因。GO 和 KEGG 分析显示，MVP 差异表达基因（DEGs）与变形运动及 PI3K-Akt、黏着斑通路相关，PAN DEGs 富集于缺氧反应和 HIF-1 信号通路。此外，作者利用 Seurat 和 SpaGCN 软件在 10X Visium 数据集中识别空间可变基因（SVGs），并与 PAN 和 MVP 上调基因重叠，得到 63 个 PAN 特征基因候选者和 53 个 MVP 特征基因候选者，筛选出排名靠前的特征基因（如 PAN 的 IGFBP5、NDRG1，MVP 的 IGFBP3、A2M），且 TCGA RNA-seq 数据显示多数特征基因在 GBM 中表达高于低级别胶质瘤（LGG），且高表达与不良预后相关。该图通过多组学数据整合和分析，明确了 GBM 不同区域的分子表达差异，筛选出 PAN 和 MVP 的特异性特征基因，并验证了这些基因与 GBM 恶性程度和预后的关联。
（二）图 2：胶质母细胞瘤中 PAN 和 MVP 特征基因的空间定位
作者选取具有明显坏死和血管增生的典型样本 UKF243，通过 Seurat 和 SpaGCN 将其斑点聚类为 6 个区域。分析发现不同区域存在特征性表达基因，如区域 0 中 APOC1 和 NDRG1 表达升高，区域 1 中 EPAS1 和 VEGFA 表达较高，区域 5 中 IGFBP7、CHI3L1 和 TAGLN 表达增加。进一步观察 PAN 特征基因（IGFBP5、MT1X、CHI3L1、NDRG1）和 MVP 特征基因（IGFBP7、IFITM3、A2M、EPAS1）的空间分布模式，发现 PAN 特征基因主要在区域 0 和 5 表达，MVP 特征基因则在区域 1、3 和 5 呈散在表达，且在 UKF243 样本中 PAN 和 MVP 基因展现出不同的空间模式。该图清晰展示了 PAN 和 MVP 特征基因在 GBM 组织中的具体空间定位，证实了这些特征基因在不同区域的表达特异性，为后续深入研究其功能奠定了空间基础。
（三）图 3：胶质母细胞瘤中 NDRG1 和 EPAS1 的表达
作者利用 Ivy GAP 数据库的原位杂交（ISH）图像，观察到 NDRG1 在 PAN 区域高表达，EPAS1 在 MVP 区域高表达。随后通过多重免疫荧光实验验证，结果显示在 GBM 切片中 NDRG1（绿色）和 HIF2A（绿色）在 PAN 区域表达水平较高，同时 CD31（粉色）和 CD44（红色）也有相应表达。该图通过原位杂交和免疫荧光实验，从分子水平直接证实了 NDRG1 在 PAN 区域、EPAS1 在 MVP 区域的特异性表达，进一步验证了前期筛选出的区域特异性基因的准确性。
（四）图 4：人胶质母细胞瘤空间转录组聚类的 UMAP 可视化及细胞类型注释
作者对 16 名患者的 GBM 空间转录组数据进行 UMAP 降维分析，根据聚类结果对细胞进行分类，并按患者来源进行颜色标记，清晰展示了不同患者样本的细胞聚类情况。通过 SingleR 注释和人工筛选，识别出 9 种主要细胞类型，包括星形胶质细胞、巨噬细胞 / 小胶质细胞、神经元、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞（OPCs）、成纤维细胞、内皮细胞（ECs）、T 细胞和脂肪细胞，并统计了每种细胞亚型在 16 名患者中的占比。此外，通过热图分析 63 个 PAN 和 53 个 MVP 特征基因在不同细胞类型中的表达情况，发现成纤维细胞和内皮细胞中这些基因的表达差异最为显著，MVP 基因在成纤维细胞和部分内皮细胞中高表达，PAN 基因则在大多数其他内皮细胞中高表达，且 CHI3L1 和 NAMPT 在内皮细胞中表达最高，其次是巨噬细胞 / 小胶质细胞。该图通过 UMAP 可视化和细胞类型注释，明确了 GBM 组织中主要细胞类型及其分布比例，并揭示了 PAN 和 MVP 特征基因在不同细胞类型中的表达差异，为后续研究细胞类型与区域特征的关联提供了依据。
（五）图 5：PAN 和 MVP 区域中内皮细胞的不同状态
作者对 GBM 空间转录组数据进行 UMAP 分析，展示了 PAN 和 MVP 区域中不同细胞类型的组成情况，发现内皮细胞在这两个区域均有分布，但组成比例和状态存在差异。通过对内皮细胞进行 UMAP 分析并根据 PAN 和 MVP 特征基因的表达进行颜色标记，进一步呈现了内皮细胞的不同状态。差异表达分析显示，PAN 相关内皮细胞高表达 CHI3L1、SNRPD3、CLU 等基因，MVP 相关内皮细胞则高表达 MGP、FABP5 及多种胶原蛋白（如 COL1A2、COL3A1、COL4A1、COL4A2）。GO 富集分析表明，MVP 内皮细胞在细胞黏附、血管生成和细胞质翻译通路中活性较高，PAN 内皮细胞则与缺氧相关通路相关。此外，体外 qPCR 实验验证了 PAN 相关基因（如 CHI3L1、SNRPD3）和 MVP 相关基因（如 FABP5、COL3A1）在相应区域内皮细胞中的高表达，与前期分析结果一致。该图深入分析了 PAN 和 MVP 区域内皮细胞的不同分子特征和功能状态，通过实验验证确认了内皮细胞在两个区域的差异，为理解 GBM 不同区域的血管生成机制提供了重要线索。
（六）图 6：胶质母细胞瘤干细胞向内皮细胞的分化
作者通过小提琴图展示了特征基因在不同细胞类型中的标准化表达水平，发现许多 PAN/MVP 特征基因在内皮细胞中高表达或特异性表达（如 AKAP12），部分基因（如 MT1X、EPAS1、THY1）在胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）和内皮细胞中均高表达。利用点图展示了内皮细胞与其他细胞类型之间的配体 - 受体对，发现 PTN/PTPRZ1 配体 - 受体对是 GSCs 和内皮细胞之间的关键介导因子，且空间热图显示 PTN 和 PTPRZ1 在患者 UKF423 中具有相似的定位。单细胞 RNA-seq 数据的 t-SNE 图展示了 GBM 中 9 种已识别细胞类型的分布，假时间分析揭示了从 GSCs 到内皮细胞的分化轨迹，相关性分析证实了 GSC 与内皮细胞之间存在较强的相关性。双重免疫荧光实验显示 GSC 标志物 CD44（红色）和内皮细胞标志物 CD31（粉色）存在共定位现象。该图通过多方面实验和分析，证实了 GSCs 具有向内皮细胞分化的能力，为解释 GBM 血管生成的复杂性及抗血管生成治疗效果不佳提供了新的机制解释。
本研究针对胶质母细胞瘤（GBM）中坏死周围假栅栏状细胞（PAN）和微血管增生（MVP）这两个关键组织病理学特征，整合批量 RNA 测序、空间转录组和单细胞 RNA 测序数据，系统探究了 GBM 不同区域的分子表达异质性和细胞组成特征。研究首先通过多组学数据筛选出 PAN 和 MVP 的特异性特征基因（如 PAN 的 NDRG1、CHI3L1，MVP 的 EPAS1、IGFBP3），并验证这些基因与 GBM 恶性程度和不良预后相关；随后明确了这些特征基因在 GBM 组织中的空间定位，揭示了不同区域细胞类型的分布差异，重点发现两种不同表型的内皮细胞分别在 MVP 和 PAN 区域富集，且具有不同的分子功能特征；最后通过配体 - 受体对分析、假时间轨迹分析及免疫荧光共定位实验，证实胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）可向内皮细胞分化。整体研究为深入理解 GBM 的进展机制提供了细胞和分子层面的全面见解，也为后续开发针对 GBM 不同区域特征的靶向治疗策略奠定了重要基础。
