01一、文章信息
发表杂志名称：International Journal of Biological Macromolecules
中文标题：单细胞和空间分析揭示 VSIG4+S100A10 + 肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）对胶质母细胞瘤免疫抑制及抗 PD-1 免疫治疗的影响
英文标题：Single-cell and spatial analyses reveal the effect of VSIG4+S100A10+TAMs on the immunosuppression of glioblastoma and anti-PD-1 immunotherapy
影响因子：8.5
发表日期：2025 年 5 月
01二、研究概述
胶质母细胞瘤（GBM）治疗中，针对肿瘤免疫微环境（TIME）的治疗策略具有潜力，但免疫检查点抑制剂类辅助免疫治疗仅对部分患者有效。GBM 相关巨噬细胞大量参与肿瘤进程，深入探究其对免疫治疗疗效的影响对改善治疗效果至关重要。本研究整合 bulk RNA 测序、单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和空间转录组学等技术，结合流式细胞术、共培养细胞实验等，对 16 例患者样本进行分析，发现 VSIG4 在巨噬细胞上高表达且与 TIME 相关，可促进巨噬细胞向 M2 型极化并推动 GBM 进展。同时首次鉴定出 VSIG4+S100A10+TAMs 亚群，该亚群与多种 T 细胞共定位，抑制 T 细胞免疫应答，是 GBM 不良预后的独立预测指标，在抗 PD-1 免疫治疗无应答患者中大量聚集，为 GBM 免疫治疗提供新靶点和方向。
01三、研究结果
（一）VSIG4 在 TAM 中的表达与免疫抑制性微环境呈显著正相关
作者通过对 Gill 等人数据的差异基因分析，在 bulk RNA 数据集里筛选出在肿瘤样本中显著高表达且变异大的基因，其中 CHI3L1、SERPINA3、AQP1 和 VSIG4 在肿瘤样本中过表达（图 1A）。将 TCGA-GBM 和 CGGA-GBM 队列样本依据肿瘤微环境（TME）免疫评估分为免疫激活（IA）组和免疫抑制（IS）组后，发现 VSIG4 在 IS 样本中显著高表达（TCGA-GBM：p=0.032；CGGA-GBM：p=0.0084），表明 VSIG4 表达与免疫抑制存在强正相关（图 1B、C）。运用 EPIC、ESTIMATE、TIMER 和 CIBERSORT 等多种方法对这两个队列进行免疫浸润分析，结果显示 VSIG4 表达与巨噬细胞浸润呈正相关，尤其与 M2 型巨噬细胞关联密切（图 1D、E）。作者按照特定方法诱导 THP-1 细胞分化，观察到细胞形态发生明显变化，THP-1 细胞为小圆形且高折光性，分化为 M0 巨噬细胞时伸出伪足、体积增大、胞质疏松呈椭圆形，M1 型巨噬细胞贴壁且部分呈梭形、细胞器突起清晰，TAM 细胞多为混合形态、体积更大、突起延长且分泌物增多（图 1F）。通过 qPCR 和流式细胞术验证 M0 建模成功后，进一步探究 TAM 最佳建模条件，发现与两种 GBM 细胞系（U87-MG 和 U118-MG）共培养的 TAM 中 VSIG4 表达显著升高（图 1G、H），且 TCGA 和 GTEx 数据的比较分析以及 CAPTC 队列的蛋白质组差异评估也支持这一发现，同时 HPA 数据库的 IHC 结果显示胶质瘤级别越高，VSIG4 表达越高。综上，作者通过多方面实验和数据分析，证实了 VSIG4 在 TAM 中的表达与免疫抑制性微环境存在显著正相关。
（二）VSIG4 表达随 TAMs 分化逐渐上调
为全面分析 VSIG4 基因在 GBM 中的特征，作者采用 BBKNN 算法整合两个数据集的 27 个样本（图 S2D），经过去除双细胞（图 S2B）、评估 RNA 污染（图 S2C）和严格质量控制后，获得 83085 个适用于后续分析的细胞，涵盖原发、复发、对新辅助治疗有应答和无应答等组别（图 2A）。利用 infercnv 分析推断染色体拷贝数变异，通过 7 号染色体扩增和 10 号染色体缺失识别出恶性细胞（图 2B、S2E）。依据 Neftel 等人的基因集，运用 ssGSEA 将肿瘤细胞分为 MES1 样、MES2 样、OPC 样、AC 样、NPC1 样和 NPC2 样六种亚型，并界定出 21 种不同细胞类型，包括癌症相关成纤维细胞（CAFs）、周细胞、内皮细胞、少突胶质细胞、Mg_TAM、Mo_TAM 等（图 2C）。结果显示 VSIG4 主要在 Mg_TAM、Mo_TAM、单核细胞和树突状细胞中表达，在其他细胞类型中极少检测到（图 2D）。作者借助 Monocle3 软件包对髓系细胞进行细胞轨迹推断，在原发和复发肿瘤中探究髓系细胞分化轨迹以寻找成簇基因表达模式（图 S2F），发现 VSIG4 位于第四簇（图 2F）；同时通过基因轨迹分析，发现 VSIG4 出现在相关基因趋势的第二条轨迹中，该轨迹还包含 S100A10、IL2RA、GPNMB 和 TMIGD3 等基因（图 2E）。这种双重轨迹分析还发现了多个与 VSIG4 表达模式相似的基因，如在 GBM 中具有免疫抑制作用的 CSF1R 和 TREM2（图 2G）。由此可见，作者通过一系列单细胞分析技术，得出 VSIG4 表达随 TAM 分化而增加且可能具有类似免疫抑制靶点功能的结论。
（三）VSIG4 促进 TAM 向 M2 表型极化
TAMs 分为促炎性 M1 型和免疫抑制性 M2 型，后者会促进肿瘤免疫抑制微环境形成。作者在 TCGA-GBM 和 CGGA-GBM 两个大型队列中进行相关性分析，发现 VSIG4 表达与三种 M2 型 TAM 标志物（MRC1、ARG1、CLEC7A）存在显著正相关，其中在 TCGA-GBM 队列中，VSIG4 与 MRC1 相关系数 R=0.62、与 ARG1 相关系数 R=0.23、与 CLEC7A 相关系数 R=0.74；在 CGGA-GBM 队列中，VSIG4 与 MRC1 相关系数 R=0.44、与 ARG1 相关系数 R=0.48、与 CLEC7A 相关系数 R=0.89（图 3A、B）。按与 VSIG4 的相关性对基因进行排序后进行 GSEA 分析，结果显示 M2 相关基因集显著富集（TCGA-GBM NES=3.03；CGGA-GBM NES=1.95），表明在 bulk 转录组水平上 VSIG4 表达与 M2 极化存在关联（图 3C、D）。使用 scgate 算法对单细胞样本按 VSIG4 表达进行分选（图 S3A），发现 VSIG4 高表达的细胞 M2 评分升高、M1 评分降低，且具有统计学意义，进一步证实 VSIG4 与 M2 极化呈正相关（图 3E）。为进一步验证，作者在与 GBM 细胞共培养的 TAM 中采用 siRNA 介导的 VSIG4 敲低（图 S3B），通过流式细胞术对 CD11b、CD86 和 CD206 标记的细胞进行分选（图 3F），结果显示靶向 VSIG4 的 siRNA 处理显著降低了 M2/M1 比值，且对已确立的 M1 和 M2 标志物进行 qRT-PCR 验证也得到一致结果（图 S3C、D）。综上，作者通过队列分析、基因富集分析和细胞实验，证实了 VSIG4 可促进 GBM 相关巨噬细胞向 M2 表型极化。
（四）抑制 TAM 中的 VSIG4 可阻碍 GBM 的迁移、侵袭和抗凋亡能力
GBM 具有高度异质性，主要分为 OPC 样、NPC 样、AC 样和 MES 样亚型。作者采用 ssGSEA 算法根据 Neftel 等人的分类对 TCGA-GBM 和 CGGA-GBM 队列样本进行评分，并与 VSIG4 表达水平进行相关性分析，发现包括 MES1 样和 MES2 样 GBM 在内的间充质（MES）亚型与 VSIG4 表达显著正相关，提示 VSIG4+TAMs 可能促进 GBM 向 MES 表型分化（图 4A）。在自然条件下对恶性肿瘤细胞进行轨迹推断分析（图 4B），结合 CytoTRACE 干性分析结果（图 S4A、B），发现肿瘤分化方向从 OPC 样向 MES 样转变，表明 VSIG4+TAMs 可能促进 GBM 进展。整合 CancerSEA 的基因集，在两个队列中进行 ssGSEA 分析并与 VSIG4 表达进行相关性分析，发现 VSIG4+TAMs 的表达与肿瘤细胞的侵袭（TCGA-GBM R=0.44；CGGA-GBM R=0.62）和迁移（TCGA-GBM R=0.50；CGGA-GBM R=0.67）相关（图 4C）。为进一步阐明 VSIG4-TAMs 对肿瘤细胞行为的作用，作者将 VSIG4-TAMs 与肿瘤细胞共培养以模拟 TME，CCK-8 实验结果显示，与 siVSIG4-TAMs 共培养后，肿瘤细胞系从 24 小时开始活力显著下降（图 4D）；划痕愈合实验表明，U87-MG 细胞系的迁移能力在 72 小时前略有抑制，而 U118-MG 细胞系从 48 小时开始迁移能力受到抑制（*P<0.05，双向 ANOVA，所有实验均进行三次独立重复）（图 4E）；Transwell 侵袭实验显示，U87-MG 细胞系和 U118-MG 细胞系与 siVSIG4-TAMs 和阴性对照 TAMs 共培养 72 小时后，侵袭能力均略有抑制（P<0.05，Student's t 检验，所有实验均进行三次独立重复）（图 4F）。由此可知，作者通过对 GBM 亚型、肿瘤细胞行为的研究以及相关实验验证，表明抑制 TAM 中的 VSIG4 可阻碍 GBM 的迁移、侵袭和抗凋亡能力。
（五）VSIG4+S100A10+TAMs 对新辅助治疗具有强抗性且表现出强效免疫抑制代谢特性
作者研究自然条件下 VSIG4 的免疫抑制作用时，发现免疫治疗无应答样本中 VSIG4 表达高于有应答样本，进而探究 VSIG4+TAMs 的特定亚群是否影响免疫治疗效果。利用在详细缩放能力上优于 t-SNE 和 UMAP 的 KNetL 图进行分析，该图长期用于单细胞分析和聚类，提取网络布局中的节点并采用 UMAP 创建最终 KNetL 图，随后对 KNetL 图结果进行 PhenoGraph 聚类，识别出 18 个不同的 TAM 亚群（图 5A）。结果显示 TAM_C15 和 TAM_C17 亚群中 VSIG4 表达极高，且 TAM_C17 主要由 Mo_TAM 组成，亚群间差异分析发现 TAM_C17 中 S100A10 特异性表达（表 S1）。结合此前基因轨迹分析结果（图 2E）中 VSIG4 和 S100A10 共享同一基因轨迹的发现，作者观察到 S100A10 和 VSIG4 在 TAM_C17 中共定位（图 5B、C），且它们在每个细胞中的表达呈显著正相关（图 S4C）。值得注意的是，与其他 TAM 亚群相比，该特定 TAM 亚群在抗 PD-1 新辅助免疫治疗无应答患者中的细胞比例最高（图 5D）。此外，使用 miloR 算法进行组间细胞丰度分析，发现该亚群在有应答和无应答病例之间存在显著差异，凸显其对新辅助免疫治疗的显著抗性（图 5E）。通过 scFEA 进行代谢分析，显示该亚群构成一个独特的簇，其三羧酸循环和嘌呤合成途径活动明显异常（图 5F）。将除 VSIG4+S100A10+TAM 外的其他 TAM 归为一个统一组，以 Cohen's d 值作为效应量指标量化 VSIG4+S100A10+TAMs 的差异代谢物，发现在原发样本中乳酸和乙酰辅酶 A 等代谢物上调，在复发样本中已知可抑制炎症细胞因子产生的 AICAR 和腺嘌呤上调，有应答样本中 2OG 和 G6P 水平升高从而增强缺氧耐受性，而在无应答样本中检测到黄嘌呤和延胡索酸等代谢物，其中延胡索酸被认为是促癌代谢物（图 5G-J）。综上，作者通过对 TAM 亚群的鉴定和分析，证实了 VSIG4+S100A10+TAMs 对新辅助治疗具有强抗性且表现出强效免疫抑制代谢特性。
（六）VSIG4+S100A10+TAMs 处于免疫炎症耗竭状态，导致患者预后不良
为阐明该独特 TAM 亚群的特征，作者将其与其他归为 Mo_TAM 和 Mg_TAM 的 TAM 进行区分以明确其独特标志。GSEA 分析显示，与其他 TAM 相比，VSIG4+S100A10+TAMs 的 M2 表型富集分数最高，而 M1 表型富集分数最低（图 6A）。干性分析表明该亚群具有旺盛的增殖能力（图 S4D、E）。通过 AUCell 评估发现，该亚群中 MYC 通路活性显著上调，同时缺氧代谢、氧化磷酸化和氧特异性反应增强，表明其处于缺氧环境，而对抗肿瘤免疫至关重要的干扰素 -γ 信号通路和 II 类抗原呈递则明显受损，且该亚群还参与 DNA 损伤修复过程，显示出较强的治疗抗性和自主修复能力（图 6B）。为评估预后意义，作者在 TCGA-GBM 和 CGGA-GBM 数据集上采用 SCISSOR 算法进行反卷积分析，该算法是通过分析来自 bulk 实验的单细胞数据来识别与表型特征（如生存结果）关联最强的细胞亚群的前沿方法。结果显示，在相应队列中，VSIG4+S100A10+TAMs 占阳性细胞群的比例分别为 71.8% 和 64.1%，与其他细胞类型的低比例形成鲜明对比（图 6C、D）。随后使用 Cibersortx 进行免疫浸润分析以确定每个样本中的细胞类型分布，根据最佳阈值将队列分为 VSIG4+S100A10+TAMs 高含量组和低含量组，进行对数秩生存分析，发现 VSIG4+S100A10+TAMs 含量高的样本与不良预后显著相关（TCGA-GBM p=0.017；CGGA-GBM p=0.0051）（图 6E、F）。由此可见，作者通过对 VSIG4+S100A10+TAMs 特征和预后价值的研究，证实该亚群处于免疫炎症耗竭状态，会导致患者预后不良，可作为评估 GBM 患者免疫治疗效果的独立预后生物标志物。
（七）VSIG4+S100A10+TAMs 与 T 细胞在空间上共定位，通过细胞通讯影响 T 细胞功能
基于上述研究结果中 VSIG4+S100A10+TAMs 在免疫治疗难治性患者中积累的现象，作者推测该亚群可能直接影响 T 细胞功能，从而降低治疗效果。考虑到位置相近的细胞相互作用更强的既定原则，作者获取来自 10X 和 Jia 等人 [16] 数据集的包含四个不同组的样本，采用 RCTD 算法对空间样本进行反卷积分析，以了解特定部位每种细胞类型的占比，随后对各部位的占比分数进行相关性分析，揭示了与各种 T 细胞类型的共定位模式：在原发样本中，VSIG4+S100A10+TAMs 与 CD4+T 细胞和增殖性 CD8+T 细胞共定位（图 7A）；在复发样本中，与四种 T 细胞类型共定位（图 7B）；在有应答病例中，与两种 CD8+T 细胞亚群和 Treg 细胞共定位（图 7C、S5A）；在无应答病例中，主要与增殖性 CD8+T 细胞和 CD4+T 细胞共定位（图 7D），且其分布与其他 TAMs 明显不同，表明具有独特的空间特征。为了解该亚群如何影响附近的各种 T 细胞，作者采用整合细胞间通讯预测方法和基于现有知识模拟细胞内信号的计算工具的综合策略，通过 LIANA 算法整合配体 - 受体对以及 NicheNet 的受体推断结果。研究发现，VSIG4+S100A10+TAMs 主要通过 LGALS9 与 CD44/PTPRC 受体相互作用来调节 CD4+T 细胞，这种相互作用促进 SMAD3 与 FOXP3 启动子结合，有效抑制 T 细胞增殖（图 7E）；除该相互作用轴外，还通过（CCL3/CCL2）-CCR5 轴和 S100A8-CD69 轴对 CD8+T 细胞和增殖性 CD8+T 细胞进行招募并促进其耗竭（图 7F、G），且在多种癌症患者中分离出的 CD8+T 细胞在耗竭的早期和晚期阶段均表现出 CD69 基因表达上调；该亚群还通过 GRN-TNFRSF1B 和 ICAM1-IL2RG 等轴维持 Treg 细胞的免疫抑制功能（图 7H）；此外，数据表明在无应答者中，除增殖性 CD8+T 细胞外，IL10-CD27 轴可能是导致其他三种 T 细胞亚群对 PD-1 免疫治疗产生抗性的关键因素。综上，作者通过空间转录组分析和细胞通讯研究，明确了 VSIG4+S100A10+TAMs 与 T 细胞的空间共定位关系及其通过多种信号轴影响 T 细胞功能的机制。
（八）通过 GBM 患者的 IHC 和 mIF 验证 VSIG4+S100A10+TAMs
为验证 VSIG4 的表达，作者对不同临床级别的 GBM 组织进行免疫组织化学（IHC）分析，发现复发 GBM 中 VSIG4 的表达高于原发 GBM（图 8A）和低级别胶质瘤（图 S5B、C），这一结果证实了此前关于 TAMs 中 VSIG4 上调的结论，也与复发 GBM 中 Mo_TAM 增加且 VSIG4 表达升高的情况一致。作者进一步研究了 TAM 中 VSIG4 和 S100A10 的共表达，以及 M2 样 TAM 的公认标志物 CD206，还有它们在 TME 中与 T 细胞的潜在空间相互作用。通过对原发和复发 GBM 组织进行多重免疫荧光（mIF）检测，作者观察到 VSIG4+S100A10+TAMs 的共定位（图 8B、D），同时荧光成像显示它们与 T 细胞邻近（图 8C），这一结果证实了空间转录组分析的结论。综上所述，作者通过临床样本的 IHC 和 mIF 实验，进一步验证了 VSIG4+S100A10+TAMs 在 GBM-TME 中的存在及其与 T 细胞的空间关联，强调了该 TAM 亚群的重要性。
（九）VSIG4+S100A10+TAMs 在 GBM 微环境中的作用及潜在功能总结
作者通过综合分析，绘制出 VSIG4+S100A10+TAMs 在 GBM 微环境中的作用机制图（图 9）。图中展示了单核细胞被招募后分化为 M1 样 TAMs 和 M2 样 TAMs，其中 VSIG4 和 S100A10 在相关细胞中表达，且该亚群处于缺氧环境，MHC II 类分子表达受影响，IFN-γ 信号通路受损，同时参与 DNA 修复过程；在代谢方面，该亚群涉及糖酵解、三羧酸循环和嘌呤合成等过程；恶性肿瘤细胞与 GBM-TAMs 之间存在相互作用，VSIG4+S100A10+TAMs 可抑制 T 细胞功能，影响免疫检查点阻断（ICB）治疗效果，而 PD-1 阻断治疗对其作用有限。总之，该图清晰地总结了 VSIG4+S100A10+TAMs 在 GBM 微环境中促进免疫抑制、影响肿瘤进展和免疫治疗效果的潜在功能及作用途径。
本研究围绕胶质母细胞瘤（GBM）的肿瘤免疫微环境（TIME）展开，通过整合 bulk RNA 测序、单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）、空间转录组学等多组学技术，结合流式细胞术、细胞共培养、免疫组织化学（IHC）、多重免疫荧光（mIF）等实验方法，深入探究了 VSIG4+S100A10 + 肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在 GBM 免疫抑制及抗 PD-1 免疫治疗中的作用。研究首先发现 VSIG4 在 TAMs 中高表达且与免疫抑制性微环境呈正相关，其表达随 TAMs 分化逐渐上调，并能促进 TAMs 向 M2 型极化，进而推动 GBM 进展；随后鉴定出 VSIG4+S100A10+TAMs 这一独特 TAM 亚群，该亚群在免疫治疗无应答患者中大量聚集，对新辅助治疗具有强抗性，表现出缺氧、高增殖、炎症耗竭的特征及异常代谢模式，且与 T 细胞在空间上共定位，通过多种信号轴抑制 T 细胞免疫功能；同时证实该亚群是 GBM 患者不良预后的独立预测指标，可作为潜在的预后生物标志物和治疗靶点。此外，研究还提出将 PD-1 阻断与选择性抑制 VSIG4+S100A10+TAMs 相结合的双靶点治疗策略，为改善 GBM 患者对现有免疫治疗的应答提供了新的思路和实验依据，尽管研究存在缺乏免疫治疗后纵向样本及体内验证等局限性，但仍为 GBM 免疫治疗领域的发展奠定了重要基础。
