影响因子：13

研究概述：癌细胞内在因素与肿瘤微环境（TME）之间的复杂相互作用决定了癌症的预后、进展和治疗效果。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是这一环境中高度多样化且复制的组成部分，就像它们在身体中的功能多样性一样，不论是在大脑中的小胶质细胞、肝脏中的Kupffer细胞还是皮肤上皮中的朗格汉斯细胞，它们在肿瘤的异质结构中也发挥着多种功能。具体而言，研究表明，TAMs能够促进癌细胞向周围组织的侵袭、肿瘤的血管化、癌细胞进入肿瘤血管、癌细胞从循环系统中渗出到肺等转移部位以及抑制抗肿瘤免疫反应。巨噬细胞可分为M1/M2，其中M1巨噬细胞与炎症功能相关，M2巨噬细胞与抗炎特性相关。随着研究的发展，巨噬细胞在TME中的角色范式也从简单的M1/M2分类转变为反映其全部功能多样性的更复杂模型。本篇文章，作者对TAM多样性进行了大规模且深入探究（17种人类肿瘤类型中的多个巨噬细胞亚群），并对其特定标志物和途径进行了广泛分析。作者将TAM亚群与各种肿瘤基因组/表型特征相关联，显示了不同亚群预测肿瘤对检查点抑制剂的反应。具体结果如下：

研究结果：

构建大规模的泛癌症巨噬细胞图谱

作者选择了17种癌症类型的32项研究，并使用标准的单细胞RNA测序管道对其进行处理（图a-b）。这些数据集包括363,315个TAMs，其中279,104个细胞来自肿瘤组织，74,982个细胞来自邻近正常组织，9,229个细胞来自其他部位（如血液、淋巴结；图c）。在这些肿瘤细胞中，73.8%来自原发肿瘤组织，18.5%来自转移瘤（图d）。肺癌在图谱中拥有最多的细胞，其次是透明细胞肾细胞癌（ccRCC）和多形性胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤（图e）。

TAM谱系具有多样性和复杂性

上文提及，一直以来关于TAM分类聚焦于M1/M2，但本篇研究作者聚焦了更多的TAM表型和功能。作者使用Louvain算法，将细胞反复分组，最终形成了23个簇（图a），并通过层次聚类进一步探讨了簇间关系（图b）。为了验证这一聚类方法，作者将已知TAM的marker映射到23个簇中（图2c）。此外，鉴于数据集的庞大，作者在23个簇中识别出罕见且之前未被识别的亚群。例如，在23个簇中，第0簇是最大的簇（总共有38,071个细胞），代表着肺泡巨噬细胞而高表达的肺泡巨噬细胞标记FABP4、MCEMP1和CD52（图c）。第1簇具有免疫调节功能，上调了硒运输蛋白SELENOP（与M2巨噬细胞极化相关）、铁运输蛋白SLC40A1（其高表达已被证明能促进TAM的M2极化），以及其他M2相关基因如PLTP、F13A1和FUCA2。第21簇的TAM表达SLC40A1和SELENOP，还高度上调了CD163和HMOX1，这些是血红素清除巨噬细胞的marker（图c）。

第2、6、7、8、10和17簇与炎症相关。例如，第2簇上调了C3（调理作用和吞噬作用），PLD4（与M1极化相关），以及MHC II类分子亚单位HLA-DPA1和HLA-DPB1。第6簇上调了CCL20（促进癌细胞迁移），CXCL3（促进胰腺癌转移）、促炎细胞因子IL1B，以及其他趋化因子CXCL2和CXCL8。类似地，第7簇与细胞因子相关，包括CCL2、CCL8、CCL4L2、CCL3L3和SPP1（已被证明能在肺腺癌中促进M2极化，以及与血管生成相关）。第8簇的上调基因包括CXCL9、CXCL10和MMP9以及干扰素诱导基因VAMP5。第17簇的TAM也显示出干扰素诱导的表型，其最高的上调基因为ISG15，以及趋化因子CXCL10和CCL8。第10簇的TAM上调了多种细胞因子，包括CCL3L3、CCL4L2、CXCL8、IL1B、TNF、CCL4和CCL3（图c, d）。

由于部分TAM具有免疫抑制功能，对TAM的治疗靶向研究也具有很大的临床应用价值。在本研究中，第3簇在大多数癌症类型中都有发现，而且出现了已知与黑色素瘤免疫治疗耐药相关的基因签名，包括高表达的SPP1、RNASE1、NUPR1和TREM2。其中TREM2是一个比较重要的基因，包括在阿尔茨海默病中维持小胶质细胞的健康，在脂质相关TAM中也有报道。而之前的实验数据也显示，抑制TREM2可以增强免疫治疗反应并抑制肿瘤生长。像第3簇一样，第4簇的TAM也上调了TREM2，但相反，它们还上调了APOE（一种脂肪酸代谢基因，与乳腺癌中的巨噬细胞亚群相关，以及是肺癌进展的潜在预后生物标志物）。当APOE被抑制时，可以促进M2极化的TAM向M1状态的转化，并增强肝细胞癌中的抗PD1免疫治疗。第5簇的TAM通过上调与细胞周期和DNA复制相关的基因来表现出增殖特性，包括上调H4C3（组蛋白成分）、TOP2A（DNA拓扑异构酶）、一些与细胞周期相关的基因包括CDK1、CDKN3和CKS1B，以及CENPF（着丝粒成分）、STMN1（参与细胞骨架）和唯一上调的增殖标志物MKI67（图c, d）。

对于某些鉴定出的TAM簇，它们在肿瘤发展和生长中的功能尚不清楚。例如，第11簇的TAM上调了金属硫蛋白MT1G、MT1X、MT2A、MT1E、MT1H、MT1F和MT1M。第13簇的TAM上调了FN1（可影响胰腺癌对化疗的反应和在头颈部肿瘤中的M2极化），以及钙结合蛋白S100A6、S100A10、S100A4（证明可促进炎症和转移，通常在应激反应中释放）。第15簇的TAM特征在于上调LYZ，一种靶向细菌细胞壁肽聚糖成分的抗菌酶，也被认为具有抗炎作用。第16簇的TAM上调了MMP9，这是一种参与细胞外基质分解的基质金属蛋白酶，并且是乳腺癌的预后因素。

肿瘤内在和环境因素共同塑造巨噬细胞表型

在上文对每个巨噬细胞簇进行了详细表征，分析其差异表达的基因和通路之后，作者开始研究不同条件下样本中TAM组成的差异（肿瘤的组织部位、组织学、基因型或分子亚型）。作者在比较CRC（原发/转移结直肠癌）和LIHC（肝细胞癌）时，检测到三种条件下五个TAM簇的比例存在显著差异。其中最显著的差异是第18簇的比例，在CRC原发肿瘤和肝转移中显著增加，但在原发肝肿瘤中相对减少（图a, b），表明CRC癌细胞内在的基因型或表型因素可能对TAM亚群有影响。此外，第6簇在LIHC和CRC肝转移中显著增加，但在原发CRC中减少（图a）。黑色素瘤（原发或转移）和GBM（胶质母细胞瘤）的比较也显示出多个巨噬细胞亚群比例的显著差异（图c, d）。例如，最显著的是第12簇，其最高差异表达基因是已知的黑色素细胞分化因子LRMDA，在黑色素瘤脑转移中相对于原发黑色素瘤和原发胶质母细胞瘤显著富集（图c, d），表明这种肿瘤基因型与周围脑组织之间的相互作用。此外，第2簇在原发黑色素瘤和原发胶质母细胞瘤中显著富集，而在黑色素瘤脑转移中则较少（图c, d）。在组织学和分子亚型方面，作者还测试了肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）之间以及不同受体状态（如HR+、HER2+、HR+/HER2+和三阴性乳腺癌）乳腺癌之间的巨噬细胞组成差异。分析显示，第6、16簇在LUSC中比例显著较高，而15簇LUAD中比例显著较高。此外，三阴性乳腺癌中的第14簇比例显著高于HR+/HER2+乳腺癌，而第2簇在HR+/HER2+乳腺癌中的比例显著高于三阴性乳腺癌（图a, b）。

TAM表型和患者对免疫检查点抑制剂的反应

因为TAM长期以来一直与治疗结果相关，尤其是对免疫检查点抑制剂（ICI）的反应。例如，对TAM从M2表型重新极化为M1表型可能会影响ICI的效果，同时还可以利用M1型TAM作为药物递送载体。因此在这23个TAM亚群中可能存在与ICI反应相关的亚群，因此作者使用包含1446名接受ICI治疗的患者队列的RNA测序数据来进一步验证。首先，作者根据每个簇的差异表达基因标记定义了单细胞簇基因表达特征，并在免疫治疗队列的RNA测序数据来验证潜在效果。作者接着定义了一组巨噬细胞特异性的特征，这些特征在评估所有细胞类型图谱时始终能识别其各自的巨噬细胞簇，包括5簇_StressMac、簇6_SPP1AREGMac、8簇_IFNGMac、11簇_MetalloMac、17簇_IFNMac3、21簇_HemeMac和22簇_IFNMac4。并使用免疫治疗队列批量RNAseq数据评估这些特征在反应者与非反应者之间的表达差异。结果发现，几个簇特征与ICI反应显著相关，包括20簇_TDoub和8簇_IFNGMac在ICI反应者中显著富集（图a）。其中，20簇由T细胞双重体与巨噬细胞组成，而8簇的最高上调基因是CXCL9，这是一种已知与T细胞招募相关的趋化因子。类似地，17簇_IFNMac3、14簇_ProliMac、11簇_MetalloMac、4簇_ICIMac2和3簇_ICIMac1在ICI反应者中显著富集（图a）。相反，18簇_ECMMac在ICI非反应者中显著富集（图a）。由于该簇与细胞外基质修饰相关，因此作者假设其抵抗机制可能是由于T细胞被排除在肿瘤之外。但作者很快推翻了这一结论，因为作者在对一般T细胞特征与ECM特征的关联分析中，观察到在免疫治疗队列中ECM特征样本上四分位数中关联的T细胞特征显著较高（图b），这表明T细胞被排除在外可能是因为细胞间更复杂的相互作用可能在发挥作用。

因为T细胞在癌症相关新抗原刺激下表现出转录程序的变化，包括在肺癌中上调CXCL13和MHC II类基因，这称之为突变相关新抗原评分（MANA评分）。作者假设TAM-T细胞相互作用可能在这种变化中发挥作用，因此接下来评估MANA评分在TAM簇分布的变化。作者选择了免疫治疗队列中基因集富集分析中最显著的四个特征（14簇_ProliMac、8簇_IFNGMac、17簇_IFNMac3和18簇_ECMMac），并测试这些簇在MANA评分上四分位数的样本中比例是否显著不同。结果发现，在MANA评分下四分位数的样本中18簇_ECMMac的比例显著较高，而在上四分位数样本中8簇_IFNGMac显著富集（图c）。并且作者发现一些细胞共同表达了巨噬细胞标记物CD68以及胶原蛋白基因COL1A1、COL1A2和COL3A1，表明这些巨噬细胞可能在组织中与胶原蛋白的生产和细胞外基质的重塑有关（图d）。此外，作者还识别出几个潜在的成纤维细胞，这些细胞在成纤维细胞与TAM之间处于中间状态。例如，18簇_ECMMac+ TAM的最近邻细胞是其他TAM，其次是成纤维细胞（图e），表明这些细胞类型之间存在细胞间通信。作者还评估了8簇_IFNGMac巨噬细胞的最近邻，发现8_IFNGMac TAM的最近邻是其他TAM，其次是CD4记忆T细胞、癌细胞和CD8记忆T细胞（图e）。相反，未属于这两个簇的巨噬细胞的最近邻是TAM，其次是中性粒细胞和NK细胞（图e）。

图谱的应用和未来研究的参考

除了促进基于数据的巨噬细胞分类方法外，作者还利用该图谱在一份口腔癌的单细胞数据进行验证（图a）。口腔癌单细胞数据的C1QB+ TAM的巨噬细胞亚群主要映射到本研究的2_C3Mac簇（图b），CD14+ Mono亚群主要映射到19_ClassMono簇，CXCL8+ TAM亚群映射到6_SPP1AREGMac，SPP1+ TAM亚群映射到16_ECMHomeoMac。许多TAM也映射到这些最常见映射之外的簇，例如口腔癌单细胞数据的CD14+ Mono TAM映射到本文的9_AngioMac簇。在口腔癌数据集中未检测到18_ECMMac TAM，这表明这种癌症类型与这种巨噬细胞分化途径负相关。对如何最好地表征TAM从M1/M2二分法转向更复杂的模型，涵盖巨噬细胞的刺激和起源，之前的研究提出了一个七部分的模型。这一模型可以解释TAM多样性，反映了巨噬细胞在不同分化阶段和刺激下的状态。因此，作者采用之前研究定义的关键标记基因，并检查了这些标记阳性细胞在每个表达量百分位中的簇成员身份（图c, d）。但这一分析这揭示了之前研究定义的关键标记基因存在很大的异质性，表明某些标记物在巨噬细胞景观中的普遍性并且许多标记物并不指示巨噬细胞的分化状态。例如，MKI67和CDK1等增殖巨噬细胞标记物属于前者类别，大多数表达这些基因的细胞属于14_ProliMac簇。同样，表达LYVE1和FOLR2的细胞主要属于1_MetM2Mac簇，而表达CXCL9的细胞主要属于8_IFNGMac簇。分布在多个簇中的标记物包括APOE、APOC1、ARG1和HES1（图c）。

研究总结：

这篇文章通过构建一个泛癌单细胞RNA测序图谱，详细分析了肿瘤相关巨噬细胞的多样性，并探讨了它们在不同肿瘤类型和治疗反应中的作用。例如，作者识别出23个TAM亚群，并展示了这些细胞在不同肿瘤类型中的广泛多样性。作者还比较不同肿瘤类型和转移状态下的TAM组成，发现肿瘤基因型和肿瘤微环境共同影响TAM的组成和功能。并且，通过分析1446名接受ICI治疗的患者数据，作者确定了特定的TAM亚群与治疗反应之间的显著关联。总的来说，本文构建的TAM图谱为理解巨噬细胞在肿瘤微环境中的作用提供了新的视角，并揭示了它们在不同肿瘤类型和免疫治疗反应中的关键角色。这一图谱不仅补充了现有的文献模型，还为未来的研究提供了全面的参考工具，推动了对TAM多样性和功能的深入研究。