一.conda安装multiqc软件
1.安装conda
2.安装python2环境
conda create --name python2 python=2.7 -c https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda/ -y
conda activate python2
multiqc1.PNG
multiqc2.PNG
3.用conda安装multiqc软件
conda install multiqc -c https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda
multiqc4.PNG
4.查看multiqc是否安装成功
multiqc -h #在使用multiqc软件前需要先激活Python环境
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multiqc 01.PNG
multiqc 01.PNG
二.获得fastq文件
1. 在NCBI中寻找两条序列(尽量选择较小的序列，便于运行)，利用prefetch下载此序列
prefetch SRR5987926
prefetch SRR5987998
multiqc02.PNG
2.将SRA文件解压为fastq格式
fastq-dump --gzip --split-files SRR5987926
fastq-dump --gzip --split-files SRR5987998
multiqc03.PNG
3.fastqc进行数据质量评价
fastqc SRR5987926_1.fastq.gz SRR5987926_2.fastq.gz SRR5987998_1.fastq.gz SRR5987998_2.fastq.gz
multiqc04.PNG
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01.PNG
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三、multiqc进行整合
在当前目录下
multiqc .
02.PNG
生成两个文件multiqc_data和multiqc_report.html，将multiqc_report.html download下来并打开该网页
四、结果分析
1.所有样本数据基本情况统计
001.PNG
重复reads的比例（%Dups）、GC含量占总碱基的比例（%GC，比例越小越好）、总测序量（M Seqs，单位：millions）
2.序列的计数
002.PNG
可以查看reads的数量和其百分比。
根据表可知该四条序列的重复序列都较多。
3.每个read各位置碱基的平均测序质量
003.PNG
横坐标——碱基的位置
纵坐标——质量分数=-10log10p（p代表错误率），所以当质量分数为40的时候，p就是0.0001。此时说明测序质量非常好。
绿色区间——质量很好，橙色区间——质量合理，红色区间——质量不好。
由此可知，四个样本的140个碱基的测序质量平均线都在绿色区域内，质量很好。
4.具有平均质量分数的reads的数量
005.PNG
绿色区间——质量很好,橙色区间——质量合理,红色区间——质量不好
由上图可知4个样本基本都在绿色区域，测序质量合格。
5.每个read各位置碱基ATCG的比列
006.PNG
reads每个位置的颜色显示由4种颜色的比例混合而成，哪一个碱基的比例大，则趋近于这个碱基所代表的颜色。
正常情况下每个位置每种碱基出现的概率是相近的。
由上图可知4个样本在14个bp前的ATCG的含量比例是非常不均匀的，可能有过表达序列的污染，测序质量不好。
6.reads的平均GC含量
007.PNG
正常的样本的GC含量曲线会趋近于正态分布曲线。
由上图可知GC含量曲线不符合正态分布曲线，曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差，测序质量不好。
7.每条reads各位置N碱基含量比例
008.PNG
当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生“N”，统计N的比率。正常情况下，N值非常小。
由上图可知样本的N碱基的含量为0，每个位置的碱基都能确定，测序质量很好。
8.序列长度的分布
009.PNG
所有样本的序列都是单一长度（151bp）。
9.每个序列的相对重复水平
010.PNG
横坐标：每个序列的相对重复水平，纵坐标：在文库中的比例
由上图可知每个样本序列的相对重复水平都小于1k，测序质量还行。
10.文库中过表达序列的比例
011.PNG
横坐标——过表达序列的比例，纵坐标——样本
一条序列的重复数，因为一个转录组中有非常多的转录本，一条序列再怎么多也不太会占整个转录组的一小部分（比如1%），如果出现这种情况，不是这种转录本巨量表达，就是样品被污染。
11.接头含量
012.PNG
4个样本的接头含量都小于0.1%
总的来说，该4个样本的重复序列太多，ATCG分布不均匀，有过表达序列污染的可能。
