单细胞文献解读 · CNS：
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Abstract
In vertebrates, multipotent progenitors located in the pharyngeal mesoderm form cardiomyocytes and branchiomeric head muscles, but the dynamic gene expression programmes and mechanisms underlying cardiopharyngeal multipotency and heart versus head muscle fate choices remain elusive. Here, we used single-cell genomics in the simple chordate model Ciona to reconstruct developmental trajectories forming first and second heart lineages and pharyngeal muscle precursors and characterize the molecular underpinnings of cardiopharyngeal fate choices. We show that FGF–MAPK signalling maintains multipotency and promotes the pharyngeal muscle fate, whereas signal termination permits the deployment of a pan-cardiac programme, shared by the first and second heart lineages, to define heart identity. In the second heart lineage, a Tbx1/10-Dach pathway actively suppresses the first heart lineage programme, conditioning later cell diversity in the beating heart. Finally, cross-species comparisons between Ciona and the mouse evoke the deep evolutionary origins of cardiopharyngeal networks in chordates.
研究背景
在脊椎动物中，位于咽中胚层的多能祖细胞形成心肌细胞和分枝状头部肌肉，但心咽部的多能性以及心脏与头部肌肉发育选择中基因程序的动态表达和机制仍然未知。作者在简单的脊索动物模型Ciona中使用单细胞基因组学来重建形成第一和第二心脏谱系以及咽部肌肉前体的发育轨迹，并且识别心咽发育选择的分子基础。研究显示FGF-MAPK信号传导可以维持多能性并促进咽部肌肉发育，而信号终止则会启动由第一和第二心脏谱系构成的泛心脏程序来定义心脏身份。在第二个心脏谱系中，Tbx1 / 10-Dach途径主动抑制第一个心脏谱系程序，调节跳动心脏中的后期细胞多样性。最后，Ciona和小鼠之间的跨物种比较暗示了脊索动物心咽网络的深层进化起源。
研究方案
sample: 848 high-quality single-cell transcriptomes ,five time points ;
单细胞建库流程：Smart-seq2（10X单细胞测序分析软件:Cell ranger，从拆库到定量）
测序数据分析介绍
Bulk RNA-seq
工具:SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit ;
比对:C.robustae C. robusta genome (joined scaffold (KH), http://ghost.zool.kyoto-u.ac.jp/datas/JoinedScaffold.zip) using
TopHat 2.0.12with parameter–no-coverage-search;基因差异分析：edgeR;
single cell RNA seq
工具:modified Smart-seq2 protocol ;
比对:与Bulk组相同，都是C.robustae C. robusta genome；
筛选：选择的单细胞有多于2000且少于6000的表达基因，表达基因在不少于三种细胞中可检测到；
Batch effects的去除：在用所有的genes进行PCA分析时，作者发现PC2,PC5,PC7都是核糖体基因或者未注释的genes，作者通过一种算法将这些PCs都进行了去除；(注：这个算法挺有意思，应该看一下)
Clustering and Find.Markers：t-SNE,Seurat’s ‘find.markers’ function with parameters test.use=‘roc’, thresh.use=1 and min.pct=0.5 ;
时序分析：通过得到前两个比对成分（注：这里说的前2个比对成分，应该就是PC1-2）的主曲线实现每个细胞的伪时间比对，每个细胞中单位速度的弧长参数确定伪时间，范围在[0，1]之间；
TVC（躯干腹侧细胞），STVC（第二躯干腹侧细胞），ASM(心房虹吸肌)，FHP和SHP(第一和第二心脏前体细胞)
结果分析
（1）早期心咽谱系的单细胞转录组图谱。为了从多能祖细胞转变为不同发育前体细胞的过程中识别基因的表达变化，作者通过流式细胞分选（FACS）从同步发育的胚胎和幼虫中纯化得到心咽系细胞，利用Smart-seq2技术进行了基于平板的单细胞RNA测序（scRNA-seq）。作者在五个时间点获得了848个单细胞转录组，涵盖了早期的心咽发育阶段（图a）。通过对从孵化后幼虫分离的fate-restricted细胞进行单细胞测序，鉴定出了Gata4 / 5/6 +第一和第二心脏前体细胞（FHP和SHP）以及Ebf +心房虹吸肌（ASM）前体细胞。差异表达分析鉴定 ①ASM/咽肌vs泛心脏特异性标志物②FHPvsSHP特异性标志物(图b)。top111个预测的泛心脏基因中包括心脏特异性genes，包括Gata4 / 5/6，Nk4 / Nkx2-5和Hand，作者通过荧光原位杂交（FISH）确认19种候选标记物的心脏特异性表达，包括Meis和Lrp4 / 8(图d)。泛心脏与咽部肌肉对比度主导晚期细胞异质性，但是FHP和SHP群体依然分离(图b)。因此，作者的分析揭示了在发育过程中祖细胞被激活的特定程序，包括共同（’泛心脏’）和心脏前体的第一vs第二心脏谱系的特异性印记。
（2）为了表征基因表达的动态变化，作者对不同时间点的单细胞转录组进行了伪时序分析，作者确定了多能祖细胞和分离的心脏和咽部肌肉分支。然而，这种无监督分析未能正确区分第一和第二心脏谱系，可能是因为共享的泛心脏genes主导了谱系特异性特征。利用不变的谱系并组合了与每个分支相对应的细胞，作者创建了第一和第二心脏以及咽肌谱系的三条单向轨迹(图a,b)。细胞沿伪时轴的分布对应于起源时间，发育轨迹表明基因表达逐渐变化的持续过程。然而，后期在伪时间轴中变化的gene与突然的生物转变terms等一致，例如细胞分裂。为了识别这种“开关式”的不连续性发育，作者利用细胞之间的相关性进行层次聚类，在心脏咽部轨迹上确定了10个假设的离散调节状态，包括两个多能状态，以及八个连续向特定发育方向的转换(图d)。
（3）作者进一步探索了调控状态进展的分子基础。作者首先关注咽部肌肉轨迹，从图1a中得知其中关键调节因子为Hand-r，Tbx1 / 10和Ebf。前两个调节状态对应于多能心咽祖细胞的连续生成（TVC和第二躯干腹侧细胞，STVC），为证实不对称细胞分裂作为第一次转变提供了生物学基础。尽管来自16hpf幼虫的新生咽肌前体细胞都表达了Ebf，但这些细胞与从14hpf胚胎中分离出的多能祖细胞聚在一起。这表明，尽管新生的咽肌祖细胞已经表达了一个关键的决定基因，但它们的转录组仍然与它们的多能母细胞相似。实际上，当细胞发生连续状态的转变时，咽肌转录组逐渐重塑，包括引发的心脏标志物的表达量下调和咽肌标志物的从头活化。此外，与Ebf功能的扰动后的表达谱的系统比较表明，包括肌原性调节因子（Mrf）（MyoD / Myf5同源物）和肌球蛋白重链3（Mhc3）等在内的候选Ebf靶基因，是在较晚的时期被激活，与转变为定型咽部肌肉状态过程中对Ebf的依赖性一致(图a-f)。
（4）成纤维细胞生长因子（FGF）-MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号传导的终止启动了心脏形成的泛心脏程序：接下来，作者研究了心脏形成期间状态转换的基因表达变化；作者聚焦于第一个心脏轨迹，其表征泛心脏程序的伪时序范围最广。从泛心脏标志物的激活和最初的咽部肌肉以及多能特异性标志物的下调解释了大多数基因表达变化(图a)。这些协调的基因表达变化解释了沿心脏轨迹的主要转变。例如，作者使用逻辑回归来确定Slit1 / 2/3在多能和FHP1状态之间的转换处被激活，并且通过FISH确认。研究人员使用每个基因的PC1来估计每个gene对离散调节状态的contribution(图c)。这表明多能状态主要由TVC特异性基因和引发的心脏和咽部肌肉标记物的组合表达决定。TVC到FHP1的转变以TVC特异性基因表达的急剧下降为特征，伴随着引发的ASM基因的下调，引发的泛心脏基因的上调和从头表达的泛心脏基因的激活。在这方面，FHP1状态可以被认为是多能TVC状态和FHP2状态之间的“过渡状态”。真正的泛心脏程序应该在第一和第二心脏谱系中表现出相似的动态变化，反映了共同的调控逻辑。值得注意的是，每个基因的表达始终在第二个心脏轨迹中延迟，从STVC到SHP1转变开始，因为SHP出生于第二代多能祖细胞，比FHP晚约2小时。然后，作者探究了在心脏谱系中触发泛心脏程序的调控开关，研究分析表明，心脏谱系特异性终止FGF-MAPK信号传导允许激活从头表达的泛心脏基因和随后的心脏分化的特异性，而心咽祖细胞中的FGF-MAPK信号传导通过维持引发的咽部肌肉发育程序或抑制心脏特异化编程来促进多能性。
（5）心脏谱系之间的差异促进具有跳动功能的心脏细胞多样性：相同的泛心脏基因可以定义心脏身份，但不同的前体细胞分别聚集在一起，揭示了第一和第二心脏谱系之间的显着差异。由于海鞘和脊椎动物的第二心脏区域具有相同来自Nk4 / Nkx2-5和Tbx1 / 10直向同源物的调节，作者探索了第二心脏轨迹以研究脊椎动物第二心脏区的发育和进化。通过利用（CRISPR）/ Cas9使部分基因功能丧失后发现Dach既是marker又是形成第二心脏谱系的关键调节因子，是防止第一个心脏谱系特异性标记物Mmp21活化的必需条件。Tbx1 / 10功能丧失抑制Dach表达，并引起Mmp21的异位激活，表明Tbx1 / 10促进第二心脏谱系的特异性，部分通过调节Dach激活的作用产生。实际上，Tbx1 / 10与FGF-MAPK平行激活Ebf并促进咽部肌肉程序，其方式类似于脊椎动物分支单体肌生成中的Tbx1功能。为了探索区分Tbx1 / 10双重功能的机制，作者使用MAP激酶激酶（MEK）抑制剂U0126，其抑制Ebf表达，并在通常形成Ebf +咽肌前体的外侧大多数心咽组织细胞中引起异位Dach活化。此外，Tbx1 / 10 错位表达和MEK抑制协同作用，在心咽祖细胞中引起早熟和异位Dach活化。总之，这些数据表明在Tbx1 / 10 +心咽祖细胞中终止FGF-MAPK信号传导足以激活Dach表达并促进第二心脏谱系形成，并证明了与Tbx1 / 10一致的不同信号环境如何促进不同的调节程序。
（6）脊索动物中保守的心咽转录特征。最近有文献报道对小鼠早期中胚层谱系的scRNA-seq分析鉴定了由高水平的Tbx1和Dach1表达标记的咽中胚层细胞群体。多色免疫组织化学染色显示Dach1表达在咽中胚层中广泛开始，并且限于背侧心包壁中的第二心脏细胞。使用已发表的scRNA-seq数据集扩展了心咽转录组的Ciona-to-mouse比较。我们使用典型相关分析（CCA）来鉴定在Ciona和E8.25小鼠胚胎中分离心脏和咽中胚层细胞的基因。然后，作者使用30个最佳相关基因独立地重新分离来自每个物种的scRNA-seq数据，并发现这些标记足以区分任一物种中的心脏和咽部肌肉细胞，从而揭示共享的转录程序 。总的来说，这个分析表明，进化上保守的转录程序，包括Ebf1，Gata4等的同源物调节基因，控制心脏与咽部肌肉的在心咽中胚层中的发育选择。
单细胞文章点评
该篇文章个人认为不再是传统意义上的图谱类或发育类文章，该篇文章对大量生物学内容尤其是在心咽发育过程中分子调节之间的转换的理解，真的叫人拍手打call!
单细胞技术只是技术，和其他测序技术一样也会过时，锦上添花的固然好，关键还是在专业领域要真正的“专业”！
想到了另一篇文章，也是做心脏发育的一篇，于2019年1月发表在Cell Report上的《Single-Cell Transcriptome Analysis Maps the Developmental Track of the Human Heart》，对心脏发育感兴趣的小伙伴可以看一下啊。
其实每一次看文章我都是抱着看看他们有木有什么新的R包可以借鉴或者是他们的代码公开后我可以进行一下原文的复现，但发现多数是以失败告终的，尤其是一些要是不看那篇文章根本不知道有这回事的包，所以不要总去想着去“秀包”。。。
没事多去看看说明文档吧，尤其是Seurat v3 的说明文档，里面增加了好多的新功能，尤其是在用于组之间比对分析时。
参考文献
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Wang W, Niu X, Stuart T, Jullian E, Mauck WM 3rd, Kelly RG, Satija R,Christiaen L. A single-cell transcriptional roadmap for cardiopharyngeal fate diversification. Nat Cell Biol. 2019 Jun;21(6):674-686\. doi: 10.1038
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