利用流式细胞仪测细胞凋亡（Apoptosis） Annexin V/PI染色法

2020/06/0240392

工作原理：

正常细胞的表面由不对称分布在质膜内叶和外叶上的脂质组成。这些脂质之一磷脂酰丝氨酸（PS），通常仅分布于质膜的内叶，因此仅暴露于细胞质中。然而，在细胞凋亡过程中，脂质不对称性消失并且PS暴露在质膜的外部小叶上。 Annexin V是一种36 kDa的钙依赖性的磷脂结合蛋白，能够与PS结合。因此，荧光标记的Annexin V可用于检测暴露于早期凋亡细胞外部的PS。Annexin V还可以染坏死细胞，因为这些细胞的膜破裂，使Annexin V可以进入整个质膜，但是Annexin V就无法区分坏细胞死（中晚期凋亡细胞）和早期凋亡细胞。因此，通过与碘化丙啶（PI）共染色，可以将凋亡细胞与坏死细胞（中晚期凋亡细胞）区分开，因为早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI能进入坏死细胞（中晚期凋亡细胞）但是被早期凋亡细胞排除在外。该方案描述通过Annexin V结合和PI摄取，然后通过流式细胞仪检测和量化凋亡细胞。

Annexin V/PI染色方法：

1）根据细胞类型，选择合适的细胞板接种培养目的细胞；

2）用细胞毒性刺激物处理细胞或通过紫外线辐射触发贴壁细胞死亡，使用明场显微镜观察细胞；

3）收集细胞，将1 × 10⁵个细胞重悬于200μL Binding Buffer中，加入4μL 0.5 mg/mL PI和2μL Annexin V-FITC溶液；

4）避光室温孵育15min；

5）用流式细胞仪进行荧光检测。（Annexin V-FITC最大激发光为488 nm，发射光为520 nm。PI最大激发光为～535 nm，发射光为 617 nm。 但是，两者都可以被488 nm激光激发。）

流式细胞术检测：

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通过Annexin V结合和PI摄取来测量细胞死亡。（A）以漫画形式描述凋亡细胞Annexin V结合和PI摄取。（i）磷脂酰丝氨酸（PS）位于活细胞完整质膜的内部小叶上，这些细胞不会被Annexin V和PI染色。（ii）PS翻转到凋亡细胞质膜的外部小叶，这些细胞在外部结合Annexin V，但仍不被PI染色。（iii）继发性坏死细胞（中晚期凋亡细胞）膜破裂， Annexin V与质膜上的PS结合，PI被吸收并与DNA结合。（B）在流式数据的点图中（左侧）以及在用放线菌素D（1μM）处理16 h并用Annexin V染色的U937细胞的点图中观察到i，ii和iii中的种群的地方Annexin V-FITC和PI（右侧）。

实验过程中的小建议（大作用）：

1） 要准备阴性对照（不加染料）、阳性对照（同时加两种染料）和单染样品（分别只加一种染料），阳性对照和单染样品细胞可以55℃水浴10min或用凋亡诱导剂诱导细胞凋亡。

2） 细胞凋亡检测的是活细胞，切勿用甲醛固定，尽量避免酶消化时间过长或用力吹打产生细胞碎片，重悬细胞后尽快上机检测。

3） Annexin V的结合依赖于钙离子，所以消化液中避免含有EDTA，否则会影响Annexin V与PS的结合。

4） Annexin V的结合不稳定，所以需要在标记时确保使用含钙离子的缓冲液，并且在半小时内上机检测。

5） 如果细胞本身表达GFP或转染了表达GFP的质粒，就会干扰FITC荧光信号，需选择其他荧光标记的Annexin V，如Annexin V-PE，并且染色过程注意避光操作。

举个例子：

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1）

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右上象限（晚期凋亡）和右下象限（早期凋亡）中的H9c2细胞是凋亡细胞。上图数据中表明，LPS组中H9c2细胞的凋亡率为27.5±0.56％，与对照组相比显著增加（P <0.05）。 此外，在LPS + Gfi-1组中，转染Gfi-1后，LPS诱导的H9c2细胞凋亡率降低了（12.3±0.37％），与LPS组的凋亡率相比明显降低（P <0.05）。 这些数据强烈表明Gfi-1能减弱LPS诱导的H9c2细胞凋亡。

文献链接：*****DOI: 10.1007/s10753-019-01095-x*

2）

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流式细胞仪分析用奥沙利铂（抗肿瘤药）处理48 h的HGC-27细胞在有或没有转染miR-374a-5抑制剂的时下细胞凋亡情况。上图数据表明，与对照组（4.69％±0.24％）相比，抑制miR-374a-5p明显诱导了细胞凋亡（9.42％±0.85％）。（Mock：未处理细胞；INC：抑制剂阴性对照；inhibitor：miR-374a-5p 抑制剂）

文献链接：DOI:10.1016/j.omth.2019.07.025**

3）

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Annexin V

凋亡样本两色分析测定数据。右下象限中的细胞处于凋亡早期，右上象限中的细胞处于凋亡晚期，通常在测定时主要关注这两个象限。（A）用抗Fas抗体（未用PI染色）处理过夜的Jurkat细胞。（B）Jurkat细胞用抗Fas抗体处理过夜，并用PI染色。（C）Jurkat细胞用抗Fas抗体处理过夜并用Annexin V染色。（D）Jurkat细胞用抗Fas抗体处理过夜并用Annexin V和PI染。（E）除了在1mM EDTA存在下进行染色以外，其他与D相同，说明EDTA影响了Annexin V与PS结合。

文献链接：DOI: 10.1101/pdb.top093773**

参考文献

1. Crowley L C, Marfell B J, Scott A P, et al. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2016.

2. Wallberg F, Tenev T, Meier P. Analysis of Apoptosis and Necroptosis by Fluorescence-Activated Cell Sorting[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2016.

3. Duensing T D, Watson S R. Assessment of Apoptosis (Programmed Cell Death) by Flow Cytometry[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2018.

4. Zheng Y, Li S, Hu R, et al. GFI-1 Protects Against Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Responses and Apoptosis by Inhibition of the NF-kappaB/TNF-alpha Pathway in H9c2 Cells[J]. Inflammation, 2019.

5. Ji R, Zhang X, Gu H, et al. miR-374a-5p: A New Target for Diagnosis and Drug Resistance Therapy in Gastric Cancer[J]. Mol Ther Nucleic Acids, 2019, 18: 320-331.
转自：利用流式细胞仪测细胞凋亡（Apoptosis） Annexin V/PI染色法_清华大学生物医学测试中心 http://center.biomed.tsinghua.edu.cn/index.php?c=show&id=409