工作原理：
正常细胞的表面由不对称分布在质膜内叶和外叶上的脂质组成。这些脂质之一磷脂酰丝氨酸（PS），通常仅分布于质膜的内叶，因此仅暴露于细胞质中。然而，在细胞凋亡过程中，脂质不对称性消失并且PS暴露在质膜的外部小叶上。 Annexin V是一种36 kDa的钙依赖性的磷脂结合蛋白，能够与PS结合。因此，荧光标记的Annexin V可用于检测暴露于早期凋亡细胞外部的PS。Annexin V还可以染坏死细胞，因为这些细胞的膜破裂，使Annexin V可以进入整个质膜，但是Annexin V就无法区分坏细胞死（中晚期凋亡细胞）和早期凋亡细胞。因此，通过与碘化丙啶（PI）共染色，可以将凋亡细胞与坏死细胞（中晚期凋亡细胞）区分开，因为早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI能进入坏死细胞（中晚期凋亡细胞）但是被早期凋亡细胞排除在外。该方案描述通过Annexin V结合和PI摄取，然后通过流式细胞仪检测和量化凋亡细胞。
Annexin V/PI染色方法：
1）根据细胞类型，选择合适的细胞板接种培养目的细胞；
2）用细胞毒性刺激物处理细胞或通过紫外线辐射触发贴壁细胞死亡，使用明场显微镜观察细胞；
3）收集细胞，将1 × 105个细胞重悬于200μL Binding Buffer中，加入4μL 0.5 mg/mL PI和2μL Annexin V-FITC溶液；
4）避光室温孵育15min；
5）用流式细胞仪进行荧光检测。（Annexin V-FITC最大激发光为488 nm，发射光为520 nm。PI最大激发光为～535 nm，发射光为 617 nm。 但是，两者都可以被488 nm激光激发。）
流式细胞术检测：
通过Annexin V结合和PI摄取来测量细胞死亡。（A）以漫画形式描述凋亡细胞Annexin V结合和PI摄取。（i）磷脂酰丝氨酸（PS）位于活细胞完整质膜的内部小叶上，这些细胞不会被Annexin V和PI染色。（ii）PS翻转到凋亡细胞质膜的外部小叶，这些细胞在外部结合Annexin V，但仍不被PI染色。（iii）继发性坏死细胞（中晚期凋亡细胞）膜破裂， Annexin V与质膜上的PS结合，PI被吸收并与DNA结合。（B）在流式数据的点图中（左侧）以及在用放线菌素D（1μM）处理16 h并用Annexin V染色的U937细胞的点图中观察到i，ii和iii中的种群的地方Annexin V-FITC和PI（右侧）。（左上角为机械性坏死或裸核）
实验过程中的小建议（大作用）：
1） 要准备阴性对照（不加染料）、阳性对照（同时加两种染料）和单染样品（分别只加一种染料），阳性对照和单染样品细胞可以55℃水浴10min或用凋亡诱导剂诱导细胞凋亡。
2） 细胞凋亡检测的是活细胞，切勿用甲醛固定，尽量避免酶消化时间过长或用力吹打产生细胞碎片，重悬细胞后尽快上机检测。
3） Annexin V的结合依赖于钙离子，所以消化液中避免含有EDTA，否则会影响Annexin V与PS的结合。
4） Annexin V的结合不稳定，所以需要在标记时确保使用含钙离子的缓冲液，并且在半小时内上机检测。
5） 如果细胞本身表达GFP或转染了表达GFP的质粒，就会干扰FITC荧光信号，需选择其他荧光标记的Annexin V，如Annexin V-PE，并且染色过程注意避光操作。
右上象限（晚期凋亡）和右下象限（早期凋亡）中的H9c2细胞是凋亡细胞。上图数据中表明，LPS组中H9c2细胞的凋亡率为27.5±0.56％，与对照组相比显著增加（P <0.05）。 此外，在LPS + Gfi-1组中，转染Gfi-1后，LPS诱导的H9c2细胞凋亡率降低了（12.3±0.37％），与LPS组的凋亡率相比明显降低（P <0.05）。 这些数据强烈表明Gfi-1能减弱LPS诱导的H9c2细胞凋亡。
文献链接：DOI: 10.1007/s10753-019-01095-x
原文链接：
利用流式细胞仪测细胞凋亡（Apoptosis） Annexin V/PI染色法_清华大学生物医学测试中心 (tsinghua.edu.cn)
