中国科学院遗传与发育生物学研究所许操团队在国际顶级学术期刊Cell发表“Engineering source-sink relations by prime editing confers heat-stress resilience in tomato and rice”中文译为“通过引导编辑器改造源库关系赋予水稻和番茄的耐热性”。
其实启动子编辑的文章已经多篇发表，冷泉港的番茄WOX9启动子编辑，遗传发育所李家洋老师余泓老师课题组关于IPA1的启动子编辑文章也非常精彩。除了这些通过随机编辑启动子的文章，在启动子区域进性定向编辑的文章也有不少，比如国际水稻所发表在NBT上的“Broad-spectrum resistance to bacterial blight in rice using genome editing”文章，定向突变水稻白叶枯感病基因SWEET启动子区的Tal结合位点EBE，上海交通大学的陈功友老师也两篇这样的文章发表，分别发表在MP和PBJ上，通过将EBE元件删除掉，创制具有抗病性的水稻品种。与这篇文章类似的，密苏里大学杨兵团队在Plant Biotechnology Journal（IF：13.263）发表了研究论文“High-efficiency prime editing enables new strategies for broad-spectrum resistance to bacterial blight of rice”，通过将BB易感性（S）基因SWEET14的30bp长的AvrXa7和PthXo3重叠的EBE插入到水稻中xa23的启动子中，从而产生显性的Xa23等位基因，命名为Xa23SW14。
刚刚发表的这篇cell则是针对番茄和水稻的耐热性，选择高温抑制其表达的基因作为靶点，并且该基因高温下的转录抑制会导致高温下减产
引言
全球粮食生产的紧迫挑战
到2050年，全球农作物产量需要翻倍，以满足人口增长、饮食习惯变化以及生物燃料消费增加的需求。然而，目前的农作物产量不足，且由于气候变化引发的非生物胁迫问题，这种不足预计将进一步恶化。研究表明，种植季节温度上升2°C可能导致农作物产量下降3%至13%。因此，为保障全球粮食安全，迫切需要开发能够在正常条件下实现高产、并在热胁迫下保持稳定产量的“气候智慧型”作物。然而，作物育种仍然面临许多瓶颈。优化植物内部营养分配被认为是提高产量的一个重要方向，但目前的研究主要集中于栽培管理，缺乏对营养分配的理性设计和分子调控的有效探索。
植物源-库关系的基础理论
1928年，Mason和Maskell首次提出了植物源-库关系的概念，用于解释有限资源在植物体内的分配。源组织是光合作用同化产物（主要是蔗糖等碳水化合物）的净生产者，而库组织则是这些产物的净进口者，用于使用或储存。蔗糖是光合作用的主要碳同化产物，连同氢和氧以多种形式共同构成了植物生物量的90%左右，并且是作物产量的关键决定因素。蔗糖通过韧皮部从源组织运输到库组织，在库组织中被分解为葡萄糖和果糖等六碳糖，以支持根、花、果实、种子、棉纤维和储藏器官等库器官的生长。蔗糖的分解途径主要包括：由蔗糖酶分解为葡萄糖和果糖，或由蔗糖合酶（SuSy）分解为尿苷二磷酸葡萄糖和果糖。
蔗糖酶在植物中的关键作用
蔗糖酶分为两大类：酸性蔗糖酶和中性/碱性蔗糖酶（CIN）。其中，酸性蔗糖酶包括细胞壁蔗糖酶（CWIN）和液泡蔗糖酶（VIN），而CIN主要位于细胞质中。研究表明，CWIN在植物的生长、产量及胁迫响应中发挥了不可或缺的作用。CWIN基因已在多个主要农作物（如番茄和水稻）的驯化过程中被选择。例如，番茄中的CWIN基因LIN5被定位为控制果实糖含量和产量的主效数量性状位点。含有来自野生近缘种Solanum pennellii的LIN5等位基因的番茄品种，其果实糖含量更高；而敲低LIN5则会导致种子和果实发育不良。类似地，玉米中LIN5的同源基因MINIATURE 1（Mn1）的功能丧失会导致种子缩小，产量减少约70%。在水稻中，GRAIN INCOMPLETE FILLING 1（GIF1）编码的CWIN同源基因控制早期籽粒灌浆期的光合产物分配，并决定最终的籽粒产量。
热胁迫对作物产量的影响
热胁迫的一个生理学基础是源-库平衡的破坏，导致库器官能量供应不足、繁殖发育受限，并最终带来减产。当植物面临碳分配不足时，会出现籽粒或卵巢选择性败育的现象，这是一种典型的适应性“策略性放弃”现象。尽管这种敏感性在作物驯化过程中保留下来，但在气候变化背景下，对于农业生态系统而言却是不可取的。尽管如此，目前针对碳分配抑制优化的研究还非常有限，而CWIN的异位表达通常失败并伴随着产量损失，这进一步突出了对源-库关系精细调控的必要性。
夜间温度升高的影响及应对策略
许多作物的繁殖发育对夜间温度的升高比白天温度更为敏感。例如，当夜间温度超过24°C时，番茄的花或果实可能有高达80%的败育率。不幸的是，全球夜间增温的现象比日间更为普遍。为应对气候变化对作物产量的威胁并满足快速育种的迫切需求，本研究改进了精准编辑工具，提出了通过合理调控CWIN在果实和谷物作物中的表达，优化碳分配的气候响应型碳分配优化策略（CROCS）。
结果
热应激引起的依赖转化酶的碳分配抑制导致番茄产量损失
为了探讨热应激对番茄品质和产量的影响，我们在温室条件下对食用番茄和模式品种Ailsa Craig进行了表型分析，并从花后5天（DPA）开始监测温度（图 S1A 和 S1B）。长期（30天）热应激（平均昼夜温度为32°C/25°C）导致坐果率下降48%（图 S1C 和 S1D），果实鲜重减少63%（图 S1E），产量降低80%（图 S1F），并使反映番茄品质的糖度（Brix值）降低9%（图 S1G）。
随后，我们研究了短期急性热应激对果实产量的影响。在生长室中，通过短期（14天）暴露于40°C/30°C昼夜温度条件下，复制了产量受损的现象。热应激处理的番茄植株产生了较小的果实和畸形果（图 1A–1C），坐果率下降35%，果实鲜重减少42%，产量降低50%，同时伴有糖度的下降（图 1D–1G）。
我们在生长室中利用矮化番茄品种 Micro-Tom 追踪热应激对果实发育的高分辨率动态响应。Micro-Tom 在热应激下表现出与Ailsa Craig类似的坐果率下降和产量损失（图 S1H–S1L）。从花后5天（DPA）到30天，高温导致果实褪绿并发育延迟（图 1H），而从20 DPA 开始出现果实矮化（图 1I）。果实尺寸从应激处理开始15天后显著减小（图 1H 和 1I）。
受损的果实发育促使我们研究其“库”活性（sink activity）。热应激处理的果实中蔗糖含量比正常条件下高约8倍（图 1J），而葡萄糖和果糖含量显著下降（图 1K 和 1L）。这一现象在Ailsa Craig中也表现相似（图 S1M–S1O）。这些结果表明，转化酶（invertase）活性受到了抑制，发育中的果实出现了己糖（hexose）不足。此外，在热应激条件下，编码细胞壁转化酶的基因LIN5表达下调（图 1M 和 S1P）。相比之下，其他与蔗糖或淀粉向“库”器官分配相关的重要因子，包括SUCROSE SYNTHASE(SlSUS)、SUCROSE TRANSPORTER 1(SlSUT1)、SUCROSE PHOSPHATE SYNTHASE(SlSPS) 和GLUCAN WATER-DIKINASE 1(SlGWD1) 并未受到热应激抑制（图 S1Q）。
我们利用 CRISPR-Cas9 技术在 Micro-Tom 背景下构建了LIN5失功能突变体（lin5CR，图 S1R）。lin5CR突变体在整个发育过程中表现为矮化，果实和叶片变小（图 2A–2D）。每株产量和果实鲜重分别减少了44%和16%（图 2E 和 2F），其表型类似于 Micro-Tom 在热应激条件下的表现（图 1）。lin5CR突变体的源活性相关生理指标（如净光合 CO2 吸收速率 [A]、内源 CO2 浓度 [Ci] 和气孔导度 [gs]）与野生型相比无显著差异（图 S1S–S1U），表明突变体表型不受源活性的影响。相反，lin5CR突变体的果实中蔗糖积累，同时己糖不足，这与热应激对野生型的影响类似（图 1J–1L 和图 2G–2I）。
综合这些结果，表明LIN5在应激响应性碳分配中起关键作用，并且这一机制显著影响产量损失（图 2J）。
在LIN5启动子中整合热休克元件赋予热应激诱导能力
由于LIN5的下调是热应激条件下产量损失的根本原因，而耐热番茄品种通常表现出更高的转化酶活性，研究人员将LIN5通过广泛表达的 35S 启动子在 Micro-Tom 背景中过表达，但发现其未能提高果实产量（图 S1V）。相反，这些过表达植株表现出与lin5CR突变体相似的表型，包括植株高度降低、果实和叶片变小（图 2K–2M，图 S1W 和 S1X），以及产量下降（图 2N、2O，图 S1Y 和 S1Z）。结合LIN5过表达植株的源活性未受到影响（图 S1S–S1U），这些结果表明，LIN5的紊乱会通过破坏碳分配扰乱“库-源”平衡（图 2P）。
为了验证这一假设，研究人员进行了 14C 脉冲追踪实验，通过将 14C 标记的蔗糖喂给野生型和 35Spro:LIN5-1 植株，并监测放射性标记信号在源和库器官中的分布。结果表明，LIN5的过表达导致叶片中蔗糖的过量积累，破坏了“库-源”平衡（图 2Q）。之前的研究【22, 31】以及本研究的发现都表明，在这种背景下需要对LIN5的表达进行精细调控以优化碳分配。
热休克元件（HSEs）是热休克转录因子（HSFs）识别的 DNA 序列，用于快速激活基因表达程序【39, 40, 41】。HSFs 能够结合具有 nGAAnnTTCn 或 nTTCnnGAAn HSE 模体的 DNA 序列【39, 42】，但LIN5启动子缺乏已知的 HSE 模体。我们提出，通过在LIN5启动子中有针对性地整合 HSE 元件，可能赋予其热应激诱导调控能力，从而通过精细调控LIN5的表达优化“库”的活性（图 3A）。
为了识别一致性的 HSE 元件，研究人员对拟南芥、番茄和水稻中所有注释的小热休克蛋白靶基因（sHSPs）的启动子进行了全局分析（表 S1）。结果发现，nGAAnnTTCn 或 nTTCnnGAAn 的回文重复序列富集（图 3B，图 S2A 和 S2B）。其中，CTAGA 模体在应激响应基因中频繁出现【43, 44, 45】。考虑到序列长度对敲入效率以及启动子染色质结构的影响，研究人员选择了ATTCTAGAAT作为插入用的最小 HSE 单元。
为减少 HSE 插入对内源性 LIN5 表达模式的干扰，研究人员设立了选择目标位点的基本标准。首先，候选插入位点不应包含任何可能具有功能的顺式作用元件。其次，插入位点应位于开放染色质区域（其中结合峰根据公开的全基因组数据库相对较弱）。最后，插入位点应尽可能位于翻译起始密码子上游 1 kb 的范围内。 研究人员使用 PlantCARE 扫描了 LIN5 启动子的 2 kb 区域以避免潜在的顺式作用元件，并结合公开的 DNase-seq 和 ATAC-seq 数据集分析了 LIN5 启动子区域的染色质可及性【46】。最终选定了位于番茄 LIN5 翻译起始密码子上游 452 bp 的位置作为 HSE 插入位点（图 3C）。 检验嵌合型 LIN5 启动子（带有 HSE）的功能。研究人员通过双荧光素酶（LUC）报告基因分析测试了嵌合型 LIN5 启动子的功能（图 3D）。LUC 表达分别由以下启动子驱动：天然的 LIN5 启动子（LIN5pro）、插入 HSE 的嵌合型 LIN5 启动子（LIN5pro + HSE），以及一个含有扰乱 HSE 序列（AGGGTATTTT）的阴性对照启动子（LIN5pro + HSE scram）（图 3D 和 3E）。LIN5pro + HSE 的相对 LUC 活性在热应激 2 小时后逐渐升高（图 3F）。相比之下，LIN5pro 和 LIN5pro + HSE scram 在热应激下没有响应，表明 HSE 插入赋予了 LIN5 启动子热应激响应的上调能力。此外，LIN5pro + HSE 启动子可以被番茄 HSF 特异性识别并结合，而 LIN5pro + HSE scram 启动子不能（图 S2C）。
开发高效的定向编辑系统 CROCS
基于高效原基编辑系统的开发
转基因方法对于作物改良至关重要【47】，但代际更替可能导致共抑制和表达减弱【48】。LIN5pro + HSE 的热应激响应特性促使研究人员探索通过基因编辑将 HSE 精准插入内源 LIN5 启动子的可能性（图 3G）。然而，最大的障碍在于将 DNA 片段插入内源基因的效率和精确性。尽管原基编辑技术在动物和单子叶植物中已被证明能高效插入序列，但在双子叶植物中缺乏高效系统【49,50】。避免原基编辑引导 RNA（pegRNA）的环化，同时保持原基结合位点（PBS）和逆转录模板（RT）的完整性，对提高 pegRNA 功能和编辑效率至关重要【51,52】。为了开发适用于双子叶植物的高效原基编辑系统，研究人员利用了来源于 I-F 型 CRISPR-Cas 系统的 20-nt Csy4 识别位点【53】，以抑制 PBS 和 spacer 之间的环化，并防止 exonuclease 对 pegRNA 3′ 端的降解（图 3G 和 3H）。研究人员设计了一种基于 Csy4 的第三代原基编辑系统（PE3），命名为 Csy4-PE（图 3H）。具体而言，将 Csy4 蛋白与 Cas9（H840A）裂解酶和 RT 融合，并置于 35S 启动子下表达。pegRNA 和切割单导 RNA（nick-sgRNA）则通过黄花烟卷叶病毒（CmYLCV）启动子共同表达，并在两侧添加 Csy4 识别位点【54】。Csy4 内切酶结合其识别位点并切割融合的转录物，释放 pegRNA 和 nick-sgRNA。在切割后，Csy4 识别位点保留在 pegRNA 的 3′ 端，形成发夹结构以保护其稳定性（图 3G）【51,53】。
优化并测试编辑效率
为了测试编辑效率，研究人员以已发表的 pCXPE01 系统（U6-PE）【49】作为对照，开发了 tRNA-PE 系统作为第二对照。在 tRNA-PE 系统中，将多顺反子 tRNA 序列融合到 pegRNA 的两端，用于释放引导 RNA 而无需额外的启动子【55】。此外，研究人员优化了上述三个系统的主要原基编辑组分，包括逆转录酶的番茄密码子优化、在 nCas9 N 端和 RT C 端添加核定位信号序列，以及在 nCas9 和 RT 之间插入一个 33 氨基酸的连接肽（图 3H）。
LIN5 启动子 HSE 插入的精准编辑
为了将 HSE 插入到 LIN5 启动子中，研究人员将 Csy4-PE、U6-PE 和 tRNA-PE 构建体转化到 Micro-Tom 中，并回收了独立的转基因系（图 3I）。PCR 基因分型和大规模平行测序鉴定了各种编辑，其中两条系（标记为 “lin5-de”，意为 “期望编辑”）显示出精确编辑（等位基因 1），而六条系（标记为 “lin5-ude”，意为 “非期望编辑”）显示出不精确编辑，均来自 Csy4-PE 系统（等位基因 2–6，图 3I 和 3J）。令人惊讶的是，Csy4-PE 系统的编辑效率达到 53.3%，精确编辑率为 13.3%，而 U6-PE 系统未检测到编辑，tRNA-PE 系统无精确编辑（图 3I）。这表明 Csy4-PE 系统是针对双子叶植物基因的高效定向插入系统【49,50,56,57,58】。PCR 产物测序显示，Csy4-PE 系统在所有检测位点均无脱靶效应（表 S2）。
验证系统的广泛适用性
为了验证 Csy4-PE 系统在不同位点和插入片段长度以及不同遗传背景中的适用性，研究人员首先将相同的 HSE 插入到调控与 LIN5 不同生物过程的 FLAVIN MONOOXYGENASE (FMO, Solyc09g074430) 启动子中（图 S2D）。FMO 的期望编辑率达到 11.8%（图 S2E 和 S2F），与 LIN5 的编辑率相当（图 3I）。随后，研究人员将一个 18 bp 的调控序列插入到加工番茄品种 M82 的 ERECTA (Solyc08g061560) 基因的 5′ UTR 中（图 S2G）。期望编辑率为 11.1%（图 S2H 和 S2I），重现了在 LIN5 和 FMO 中观察到的编辑效率（图 3I）。这些结果表明，Csy4-PE 系统是一种高效且多功能的双子叶植物定制基因编辑系统。
将 HSE 敲入提升番茄 Micro-Tom 的“库器官”活性和产量
LIN5 表达的变化
为了探索 HSE 插入的效果，研究人员首先在正常和热胁迫条件下检测了 5 DPA 果实中 LIN5 的表达水平。在正常条件下，lin5-de 系的 LIN5 表达量比 Micro-Tom 高约 1.4 倍，而在热胁迫条件下高约 2.2 倍（图 3K）。在热胁迫条件下，lin5-de 的 LIN5 表达水平与 Micro-Tom 在正常条件下的表达量相当（图 3K），表明 HSE 的插入打破了 LIN5 的热诱导抑制。接着，研究人员检查了 LIN5 的组织特异性表达模式是否被扰乱。与 Micro-Tom 类似，lin5-de 系中的 LIN5 在根、茎和叶中未检测到表达，但在花蕾、子房和果实中的表达上调（图 3L）。这表明 HSE 敲入使 LIN5 特异性地在其正常表达的器官中被诱导，而没有出现异位表达扩散。
精细调控的 LIN5 对果实产量的影响
为了评估精细调控的 LIN5 表达如何影响果实产量，研究人员在人工气候生长室中，在正常条件下种植了 Micro-Tom 和 lin5-de 系（图 S3A）。lin5-de 系的新鲜果实重量增加了 26%（图 4A 和 4B），每株产量提高了 30%（图 4C）。果实均匀性是决定商业价值的重要果实品质特性。同一花序内果实成熟时间的差异常导致果实大小不均，这主要归因于花序顶端库器官活性的较弱。显著地，与野生型果实大小不均的情况不同，lin5-de 系的果实表现出显著改善的均匀性（图 S3B）。此外，lin5-de 系果实的糖度（Brix 含量）比 Micro-Tom 提高了 12%图 4D）。这些结果表明，精确敲入 HSE 到 LIN5 能在正常条件下提高果实产量和品质。
为了探索 HSE 敲入的结果，我们首先在正常和热胁迫条件下检测了 5 DPA 果实中的 LIN5 表达量。在正常条件下，lin5-de 的 LIN5 表达量比 Micro-Tom 高出约 1.4 倍，在热胁迫条件下高出约 2.2 倍（图 3K）。在热胁迫条件下，lin5-de 的 LIN5 表达量与 Micro-Tom 在正常条件下的表达量相当（图 3K），表明 HSE 的敲入解除了热诱导的 LIN5 表达抑制。接着，我们检查了 LIN5 的组织特异性表达模式是否受到干扰。与 Micro-Tom 相似，LIN5 在 lin5-de 的根、茎和叶中未检测到表达，而在花蕾、子房和果实中的表达量上调（图 3L），表明 HSE 的敲入仅在正常表达的器官中诱导了 LIN5 表达，而未出现异位表达。
为了评估经过精细调控的 LIN5 表达对果实产量的影响，我们将 Micro-Tom 和 lin5-de 植株在人工气候生长室的正常条件下生长（图 S3A）。lin5-de 果实鲜重增加了 26%（图 4A 和 4B），单株产量增加了 30%（图 4C）。果实均匀性是影响商业价值的重要品质指标。同一果穗中不同果实的座果时间差异通常导致果实大小不均，主要是由于果穗顶端的库活性较弱。显著的是，与大小不均的野生型果实相比，lin5-de 果实表现出显著的均匀性改善（图 S3B）。此外，lin5-de 果实的糖度（Brix 含量）比 Micro-Tom 提高了 12%（图 4D）。这些结果表明，在正常条件下，LIN5 启动子中 HSE 的精准敲入可以改善果实的产量和品质。接着，植物在生长室内接受短期热胁迫处理（40°C/30°C 日/夜，图 4E）。与 Micro-Tom 相比，lin5-de 的果实鲜重和单株总产量分别增加了 45% 和 32%（图 4F 和 4G），糖度（Brix 含量）提高了 9%（图 4H）。热胁迫加剧了 Micro-Tom 果实的大小不均，但对 lin5-de 无明显影响（图 4E）。
为了评估 lin5-de 在模拟商业塑料太阳能温室中的表现，植物分别在正常条件（28°C/19°C 日/夜）和高温条件（33°C/28.5°C 日/夜，图 S3C 和 S3D）下生长两个月。在正常条件下，lin5-de 显示出比 Micro-Tom 更强的生长势，表现为植株高度和生物量的轻微增加（图 4I、S3E 和 S3F），这表明增强的库活性可能同时改善了源库关系，这与之前的研究假设一致。在正常条件下，lin5-de 果实鲜重和单株总产量分别增加了 45% 和 46%（图 4J 和 4K）。糖度（Brix 含量）提高了 8%，果实大小的均匀性也有所改善（图 4I 和 4L）。在高温条件下，Micro-Tom 植株表现出严重的果实脱落和发育停滞，而 lin5-de 显示出强健的生长势并产出更多果实（图 4M）。lin5-de 果实鲜重比 Micro-Tom 高出 128%，果实大小更均匀（图 4M 和 4N）。lin5-de 的总果实产量接近 Micro-Tom 的 4 倍，且果实糖度无差异（图 4O 和 4P）。
为了研究 lin5-de 植株中果实产量和品质改善的原因，我们测量了反映源活性的光合作用参数，但在正常和热胁迫条件下，lin5-de 与野生型植株之间无统计学显著差异（图 4Q–4V）。随后通过 14C 脉冲追踪实验检查库活性。在正常条件下，lin5-de 植株子房中的 14C 信号强于野生型（图 4W），表明 lin5-de 植株更能将蔗糖分配到库器官，从而在正常条件下增加果实产量。在热胁迫条件下，14C 信号在野生型植株叶片中过度积累，而分配到子房的比例减少（图 4W 和 4X）。然而，这种由热诱导的碳分配抑制现象在 lin5-de 植株中显著缓解（图 4X）。
由于番茄生产中高温条件的频繁发生，将 HSE 精准敲入 LIN5 启动子显示出改良番茄品质并减少田间损失的潜力。
碳代谢和生长基因在 lin5-de 果实中差异表达
为了研究 HSE 敲入 LIN5 启动子对果实发育期间源库动态的影响，我们在 5 DPA 果实上进行了 RNA 测序（RNA-seq）。共识别出 1,026 个差异表达基因（折叠变化 ≥ 2，p 值 < 0.005）。其中，36.74%（377 个基因）在 lin5-de 中上调，63.25%（649 个基因）下调（图 S3G；表 S3）。在正常条件下，LIN5 在 lin5-de 果实中的表达量上调约 1.3 倍（图 S3H 和 S3Q）。这种轻微的 LIN5 诱导也上调了其他参与源库关系调控的基因（图 S3I；表 S3）。例如，SlSUT1，负责从源器官向库器官运输蔗糖的基因，35 在 lin5-de 中上调了 1.2 倍（图 S3J 和 S3R），而 SlSUS，编码参与蔗糖代谢的酶，36 上调了 1.6 倍（图 S3K 和 S3S）。这表明通过调节 LIN5 表达，源库关系相关的基因可以协同增强。库活性的增强反馈促进了源活性增加，62 与此一致的是，SlSPS，编码源强度的主要决定因子，37 在 lin5-de 植株中上调了 1.4 倍（图 S3L 和 S3T）。
未成熟的绿色番茄果实经历了一个暂时的淀粉积累过程，其转化对于果实发育至关重要。SlGWD1，编码调控这一过程的关键酶，38 也上调了 1.73 倍（图 S3M 和 S3U）。
除了调节源库动态的基因外，其他与生殖发育，尤其是果实发育和果实大小相关的基因也因库容量的增强而上调。例如，WUSCHEL 相关同源盒 1（图 S3N 和 S3V），已知通过促进芽顶分生组织增殖、心皮和幼果发育来决定果实大小，63 在 lin5-de 植株中上调了 3.2 倍。fw3.2，番茄果实大小和重量在驯化过程中选育的基因，64 上调了 2 倍（图 S3O 和 S3W）。最终的果实大小和重量由细胞分裂的频率和/或细胞周期阶段的持续时间决定。因此，细胞分裂蛋白激酶 10（图 S3P 和 S3X）的表达上调了 3 倍，这一基因通过六碳糖诱导细胞分裂。65
总的来说，精细调控源库基因和果实发育基因解释了 lin5-de 植株增加的果实鲜重、改善的果实均匀性和更高的产量表型。
CROCS优化源库关系以挽救温室和露地番茄因热应激导致的产量损失
通过优化碳分配，Micro-Tom 的果实产量和质量得到了提升，这促使我们在广泛使用的餐桌番茄品种 Ailsa Craig 中研究其应用。我们将前述的 prime-editing 构建体转化到 Ailsa Craig 中，并生成了 37 个独立的转基因植株。经过编辑的9条线，其中五条实现了期望的编辑，期望编辑效率为13.5%（图S4A），验证了我们系统在番茄中的高效率。
一个精确敲入 HSE 的株系，命名为 ac-lin5-de，被鉴定出来并用于在商业塑料太阳能温室和露地条件下进行转基因无子的同源二代后代的全面性能评估（图 5）。在温室的正常条件下（28°C/19°C 日/夜，图 S4B 和 S4C），ac-lin5-de 植株的果实坐果增多，果实尺寸明显增大，导致果实鲜重比 Ailsa Craig 增加了 11%（图 5A–5C）。令人惊讶的是，ac-lin5-de 平均产量提高了 47%，且 Brix 含量没有任何妥协（图 5D 和 5E）。
Ailsa Craig 的不确定性对称生长习性和大生物量使得在温室内进行大规模热应激产量试验变得具有挑战性。为克服这一挑战并模拟商业温室环境的热处理，我们在植物开始开花后，在温室中对植物加了一层透明塑料膜（图 S4D 和 S4E）。这一方法能将白天气温提高到 32°C（32°C/21°C 日/夜，图 S4F），足以显著减少 Ailsa Craig 的果实坐果（图 5A、5B、5F 和 5G）以及果实鲜重（图 5C 和 5H）。与正常条件相比，平均地块产量减少了 36.7%（图 5D 和 5I）。而在 ac-lin5-de 植株中，果实鲜重和平均地块产量分别比 Ailsa Craig 高 35% 和 33%（图 5H 和 5I）。值得注意的是，HSE 敲入拯救了 56.4% 的产量损失（图 5D 和 5I），且 ac-lin5-de 植株的 Brix 含量也有所提高（图 5J）。
为了研究 HSE 敲入植物在不同生长季节中的表现，我们进行了大规模的地块产量测试，并在较长时间内对植物施加较高温度的条件（图 S4G）。与野生型植物相比，ac-lin5-de 植株的果实鲜重增加了 15.7%，果实坐果率增加了 11.1%（图 S4H 和 S4I），并伴随着 7.4% 的收获指数提高（图 S4J）。ac-lin5-de 植株的平均地块产量增加了 32.8%，且 Brix 含量未受到影响（图 S4K 和 S4L）。在长期热应激处理下，植物从苗期开始生长在较高温度下。与 Ailsa Craig 对照组相比，ac-lin5-de 植株的果实鲜重和果实坐果率分别提高了 8.5% 和 21.3%（图 S4M 和 S4N）。我们调查了果实坐果率增加的原因。四分体阶段的花粉分离和花粉染色表明，HSE 敲入并未影响花粉发育或成熟花粉的活力（图 S4O–S4T），这表明 ac-lin5-de 植株的果实坐果率增加主要归因于改善了对幼果的碳供给，从而减少了受精后果实的自然脱落。一致地，ac-lin5-de 植株的收获指数和平均地块产量分别提高了 13.6% 和 26.4%（图 S4U 和 S4V），且 Brix 含量未受到影响（图 S4W）。这些结果表明，HSE 敲入 LIN5 启动子可以在正常条件下提高果实产量，并在受保护的栽培模式下减少热应激造成的产量损失。
接着，我们在配备实时温度传感器的露地条件下调查了 ac-lin5-de 植株的表现（图 S5A 和 S5B）。在露地的正常条件下（32°C/22°C 日/夜），ac-lin5-de 植株的果实坐果率显著高于 Ailsa Craig（图 5K 和 5L），导致平均地块产量增加了近 14%，且果实鲜重和 Brix 含量没有受到影响（图 5M–5O）。为了模拟露地的热应激，我们在开花后覆盖了透明塑料膜（图 S5C 和 S5D）。正如预期，热应激（38°C/24°C 日/夜）比正常条件下减少了 Ailsa Craig 和 ac-lin5-de 植株的果实坐果和产量（图 5K–5N 和 5P–5S）。在热应激下，ac-lin5-de 的平均地块产量比 Ailsa Craig 高出近 28%（图 5S）。果实鲜重和 Brix 含量没有显著差异（图 5R 和 5T）。重要的是，当日夜平均温度分别增加了 6°C 和 2°C 时，Ailsa Craig 植株失去了 20.3% 的产量，而 ac-lin5-de 植株的产量损失完全得到了拯救（图 5N 和 5S），这表明 HSE 敲入能够在露地热应激条件下实现稳定的产量
为了测试 CROCS 在不同番茄品种中的广泛适用性，我们使用相同的 Csy4-PE 构建体在额外的番茄品种 M82 和现代鲜食番茄自交系 Yuanwei-1 (YW1) 中靶向敲入 HSE 至 LIN5 启动子。两个品种都表现出了 LIN5 在热应激下的抑制作用（图 S5E 和 S5F）。在具有期望编辑的 m82-lin5-de 和 yw1-lin5-de 植株中，LIN5 的表达分析显示，与 Ailsa Craig 和 Micro-Tom 一样，热应激下 LIN5 表达呈上调（图 S5G–S5J）。在多个品种中观察到的一致效应，尽管它们有不同的生长习性，进一步验证了 CROCS 策略的可靠性和广泛适用性。总体而言，HSE 靶向敲入通过在正常条件下提升 LIN5 表达，同时在热应激下减轻 LIN5 抑制，成功实现了碳分配的热响应优化。CROCS 用于调控 CWIN 表达，使番茄植株能够根据环境变化调整源库关系，从而在正常条件下实现更高的产量，在热应激下实现稳定的产量，这一策略可应用于不同的栽培环境（图 3A）。
CROCS 在水稻中实现高效的原编辑并提高稻田产量
鉴于细胞壁转化酶在植物中的功能保守性以及成功地在各种番茄品种中工程化 LIN5 功能，我们接下来将 CROCS 应用到一种主食谷物——水稻中。GIF1 启动子的突变在水稻驯化过程中被选择出来，但在现代优良水稻种质中没有进一步被选择【20,66】。因此，我们通过向 GIF1 启动子中插入 HSE 来利用细胞壁转化酶工程在水稻中的作物改良潜力。我们将番茄优化的原编辑系统适应于水稻，基于 pCAMBIA1300 向量【68】进行了改造，采用了水稻密码子优化的 M-MLV RT 和一个新的结构 RNA 模体 evopreQ152，放置在 pegRNA 的 3' 端，以保护其免受外切酶降解，并命名为 pCAM-PE（图 6A）。按照之前选择目标位点的三项标准，我们选择了 −427 bp 的位置来插入 HSE。我们选择了 japonica 水稻品种 Zhonghua 11（ZH11），作为水稻遗传学和生物技术实验的目标品种【69】。获得了 37 个独立的转基因系，其中三个系（gif1-de）在精确插入 HSE。精确编辑的效率达到了 8.1%（图 6B 和 6C）。对三个位点的 PCR 扩增子进行测序，排除了脱靶效应（表 S2）。
我们评估了在北京和海南的水稻田中不含转基因的纯合子 gif1-de 植株的表现，这些田地配备了实时温度传感器，并采用了当地农民通常使用的种植密度（图 6D，S6A 和 S6B）。在北京的正常条件下（抽穗期日/night温度为 30°C/20.5°C），gif1-de 植株在每个地块中通常表现出比 ZH11 更强的生长活力、更好的均匀性和更饱满的穗粒（图 6D–6F）。这些植株在分蘖数、穗长、主穗枝数和千粒重方面与 ZH11 没有显著差异（图 6G–6I 和 S6C–S6F）。然而，它们在株高、二级穗枝数和每穗粒数方面显著增加（图 6G–6L）。这些表型表明，将 HSE 插入 GIF1 启动子可能通过增强碳分配优化源库关系，类似于番茄。对此的支持证据是，gif1-de 植株的结实率提高了 7%，而收获指数提高了 10.8%，并且与 ZH11 相比，空粒或畸形粒较少（图 6I，6M 和 6N）。与 ZH11 相比，gif1-de 植株的单株粮食产量和每个地块的粮食产量分别提高了大约 20% 和 13%（图 6O 和 6P）。
我们在海南进行了更大规模的产量试验，海南的气候条件与北京不同。每个基因型种植了 13,260 株水稻，分为五个区块，每个区块由两个面积为 100 m²、包含 2,652 株的地块组成（图 7A 和 7B）。在正常条件下（抽穗期日/night温度为 29°C/20°C）（图 7A 和 S6G），gif1-de 植株在分蘖数、株高、穗长、主穗枝数（图 S6H–S6M）和千粒重（图 7F 和 S6I）方面与 ZH11 没有显著差异。然而，gif1-de 植株在二级穗枝数（图 7C）、结实率（图 7D）和每穗粒数（图 7E）方面有所增加，这与在北京观察到的表型一致（图 6K–6M）。因此，gif1-de 植株的单株粮食产量和每个区块的粮食产量分别提高了大约 8.5% 和 7.5%（图 7G 和 7H）。这些结果表明，将 HSE 插入 GIF1 启动子可改善库器官生长，并在正常条件下提高水稻的粮食产量。
定制的Prime编辑GIF1挽救了水稻的热应激引起的产量损失
在水稻的灌浆阶段，热应激抑制了蔗糖转化为半乳糖和葡萄糖，从而导致种子废弃和空粒的形成。研究表明，最低生长期气温每升高1°C，水稻的产量就会减少大约10%。为了评估CROCS策略是否可以挽救热应激引起的水稻产量损失，我们在水稻田里进行了一次热应激实验，使用了ZH11和gif1-de植株，并用透明塑料薄膜覆盖，模拟热应激条件。此处理使白天气温提高了大约5°C，夜间提高了3°C，达到36°C/24°C的白天/夜间温度。
ZH11在热应激下的表现：在热应激条件下，ZH11植株的植株高度和分蘖数减少。虽然穗长和分支数没有变化，但结实率和每穗粒数分别下降了16.3%和18.9%。千粒重也下降了7.4%，导致每株和每块的产量分别减少了32.2%和37.9%。这表明热应激显著影响了水稻的生殖发育和贮藏器官功能，导致了显著的产量损失。
gif1-de在热应激下的表现：在热应激条件下，与ZH11相比，gif1-de植株的分蘖数、植株高度、穗长或主穗分枝数没有显著变化。然而，gif1-de植株的次级分枝数增加了7%。次级及更高阶分枝由于碳分配效率差，较容易发生花朵和种子废弃。在此条件下，gif1-de植株的结实率提高了10.5%，并且最后三层高阶分枝的粒数增加了11.8%。这导致每穗粒数增加，进而提高了总产量。
综合效应：这些结果表明，将HSE插入GIF1启动子不仅促进了高阶穗分枝的生长，还减轻了热应激下的种子废弃现象。这些改进还伴随着千粒重增加了4.9%和收获指数提高了23.3%，表明贮藏器官生长的优化促进了生殖发育的协调发展。这些对贮藏器官生长的改进导致了gif1-de植株每株产量和每块产量分别提高了26%和25%，并且gif1-de植株恢复了40.9%因热应激导致的产量损失。
为了验证这一点，我们从上述精英种质中选取了三种近期获得批准并广泛种植的优良品种，即无忧稻-4（WYD-4）、龙耕-31和中科丰-5，分析了GIF1的表达。在热应激条件下，这三种品种的GIF1表达均受到抑制，且热应激抑制的程度与ZH11无明显差异（图S7B–S7E），这与基因组分析的结果一致，表明这些品种中GIF1并未被改良。我们使用了与ZH11相同的Prime编辑构建体，将HSE插入到WYD-4的GIF1启动子中。获得了具有理想HSE插入的T0植株（wyd-4-gif1-de），并以未编辑的WYD-4 T0植株作为野生型对照。常规条件下，wyd-4-gif1-de的GIF1表达上调（图S7F）。在热应激条件下，HSE插入缓解了GIF1的抑制作用，使其表达比对照组提高了1.96倍，类似于在gif1-de和ZH11植株中观察到的效果（图S7G–S7I）。
我们使用了五个独立的T0植株（wyd-gif1-de）和未编辑的WYD-4进行初步的表型比较。结果表明，wyd-gif1-de植株的粒型更大，千粒重增加了10.4%（图S7J和S7K）。因此，wyd-gif1-de植株的每株产量和收获指数分别增加了约23.3%和7.8%（图S7L和S7M）。这些结果表明，通过CROCS合理设计GIF1的表达，为开发其在作物改良中的潜力提供了高效的方法，补充了传统育种方法，创造了可能在常规育种实践中被忽视或未充分探索的宝贵遗传变异。
讨论
自1928年提出源-库理论以来，它在植物生理学和发育生物学中发挥了至关重要的作用，并且扩展到农业生产和粮食安全领域。随着我们对其调控机制的理解加深，以及基因工程技术（如转基因或基因编辑技术）的发展，源-库相关基因在一定程度上已被操控。然而，这通常伴随着一个权衡，导致碳分配失衡，从而产生不利影响。此外，许多源-库相关基因仅需适度的上调就能发挥其功能，但目前尚缺乏高效的工具来实现这种表达水平。随着现代作物育种的日益深入和集成基因组学方法的进步，大多数重要的产量基因已被识别并使用，这突显了在应对全球气候变化和人口增长的挑战中，需要丰富遗传资源以提高产量的迫切性。如果新的方法能够使源-库相关基因具备响应环境变化的自我调控能力，它将有可能创造新的遗传变异，在有利条件下实现高产，在不利条件下实现稳定的产量。
在本研究中，我们通过建立高效的Prime编辑系统，开发了CROCS策略，允许精确地将热响应元件插入到一个重要碳分配基因CWIN的启动子中。通过这种定制编辑，精英番茄和水稻品种在热应激下表现出更精细的反应，通过上调LIN5/GIF1的表达，而不破坏其空间表达模式。这种表达将热应激反应中的碳分配平衡转回到生长和发育上，从而提高了两个主要作物在商业种植条件下的产量，并减少了热应激导致的产量损失。这一策略迅速而精确地实现了源-库关系的优化，并为在有利条件下实现更高产量和在不利条件下实现稳定产量的长期目标迈出了重要一步。
广泛的研究已识别出与产量、质量和抗性相关的许多中心基因。遗憾的是，这些基因中的许多与多个基因网络相关，当它们被异位表达或敲除时，常常出现“更多并不更好”的效果，导致产量惩罚或适应性代价。通过基因编辑合理设计这些基因的调控区域，以实现定制的、气候智能的表达模式，可以加速这些基因在育种中的应用，从而丰富育种基因库并显著提高育种效率。幸运的是，许多顺式调控元件已被识别，能够响应不同的胁迫。CROCS提供了一种高效而精准的育种策略，可以快速创造出气候智能型作物，满足未来的粮食需求。此外，它还提供了多功能的工具和可行的方法，助力基础研究，为研究的应用提供了铺路的基础。从更广泛的角度来看，引入气候响应顺式元件将推动植物基因调控序列的直接进化，使基因获得新的时空表达模式。这反过来重新连接了基因表达的分子网络，使其能够响应环境变化，为研究基因型、表型和环境之间的分子关系及其对生态系统的适应提供新的视角。
研究的局限性
尽管我们通过优化的Prime编辑系统在不同物种的不同基因启动子中有效且精确地插入了HSE，并提出了目标位点选择的原则，但染色质结构的复杂性本身意味着目标选择仍存在一定的不确定性，无法保证所有选定的目标都能够实现高效且精确的插入。这一情形类似于CRISPR-Cas9基因编辑中设计目标位点的情况。尽管一些目标在所有设计标准中得分较高，但由于染色质结构的复杂性或其他未知原因，某些目标可能仍然无法编辑。这就需要根据目标选择的原则对其他目标进行更改。此外，目前大多数番茄和水稻品种为杂交品种，其亲本通常是种子公司专有的，大部分学术实验室无法访问。因此，我们使用了多种不同的现代精英番茄和水稻品种进行工程化，并在不同的种植模式、种植规模、气候区域、田间地点和生长季节中进行产量试验。
总结一下
这篇文章的思路启动子插入响应元件是简单的，甚至是已经在别的研究中尝试过的实验方法，但是本文的遗传表型非常显著，而且使用了两个物种进行验证，尤其是水稻，收集了多年不同条件下的数据，另外，这篇文章巧妙地引入了源库流这么一个经典的教科书概念，让这篇文章的level高了很多。
总之，遗传表型显著是最重要的，不要怕做的东西简单，只要能找到好的遗传表型，再结合适度的工作量来严密地验证结果，简单的实验思路也发顶刊，共勉各位
