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分享一篇多肽信号在胚胎与胚乳之间移动，调控胚胎角质层发育的文章。

摘要概述

在胚胎发育早期，胚胎中产生TWISTED SEED1(TWS1)小肽的前体，通过初生不连续角质层的空隙，扩散到胚乳中，由胚乳特异表达的ABNORMAL LEAF SHAPE1(ALE1)酶加工成活性肽，回到胚胎中，与胚胎特异表达的受体激酶GASSHO1/2(GSO1/2)识别，调控形成完整的胚胎角质层。

背景补充

植物的角质层（The plant cuticle）是由疏水的脂质和蜡质分泌到表皮细胞的细胞壁外侧后形成的。

植物角质层示意图.png

在拟南芥胚胎发育的早期，胚胎角质层是初生不连续的，到心形胚时期，胚胎表皮细胞外侧形成完整的角质层，将胚胎细胞与周围的胚乳细胞等隔开。

心形胚时期胚胎角质层.png

GASSHO1 (GSO1) 和GSO2 受体激酶在胚胎中表达，影响在胚胎发育过程中影响角质层的功能。gso1 gso2 双突变体表型：对亲水性燃料的透性增强，50-80%的子叶融合。
转录因子ZHOUPI (ZOU) 和ABNORMAL LEAF SHAPE1 (ALE1)是两个胚乳特异的转录因子（endosperm specific proteins）。有研究表明 GSO1、GSO2与ZOU、ALE1在同一条通路上调控胚胎发育。

胚胎发育表型.png

枯草杆菌蛋白酶（subtilase）在胚乳中表达，能够对肽前体进行加工，TWS1 前体和GASSHO 受体在胚胎中表达。TWS1在2016年被报道与角质层的沉积有关。

tws1.png

一、TWS1可能与GSO共同调控胚胎角质层发育

被子植物的种子可以划分为三个区间：合子胚、胚乳、种皮。
CASPARIAN STRIP INTEGRITY FACTORs (CIFs)是一种酪氨酸硫酸化多肽【个人注：酪氨酸硫酸化多肽需要进行翻译后修饰，该类多肽有：PSK\PSY\RGF，通过酪氨酸硫酸化转移酶TPST进行催化】，CIF1/2作为GSO1/2的配体，调控根内皮层中凯氏带的形成。那CIFs是否调控胚胎角质层的发育呢。作者沿着这条思路，构建遗传材料cif1 cif2 cif3 cif4，并未观察到种子扭曲、高渗表型表型(fig. S1A)。

S1A.png

但是在TPST的敲低sgn2-1和敲除tpst-1突变体中，观察到与ale1相似的种子扭曲、高渗表型表型。这暗示着，存在某种硫酸化多肽调控种子的发育，虽然该肽不是CIFs。【注：TPST作为一种酪氨酸硫酸化酶，其突变影响种子发育，也就说明很可能是该酶坏掉后，该酶催化的某种多肽也坏掉了，导致影响种子发育。】
到此已知，TPST单突有表型，GSO1/2有表型且明确知道调控胚胎角质层。那么TPST是否与GSO1/2在一条信号通路上干活呢？
借助遗传材料，tpst-1 gso1-1 gso2-1和gso1-1 gso2-1表型一致，说明三者在一条通路上。【在gso1-1 gso2-1双突的基础上，敲除TPST，如果不在一条通路，应该是出现表型更加严重，或者表型不一致】。

TPST两类突变体表型.png

tpst-1 ale1-4这两类翻译后修饰酶，的双突，与gso1-1 gso2-1表型也相似，于是作者认为TPST与ALE是两条平行的调控通路。【这里没看懂是啥意思，个人理解是：根据tpst-1 ale1-4双突表型都比各自的单突表型严重，所以二者是在两条通路上，加之考虑到二者是两种不同的加工酶，所以就更加坐实是在两条通路上？】

*tpst-1 ale1-4*表型.png

在2016年报道了TWS1调控胚胎角质层，这里作者重新敲除得到了tws1的突变体，与 gso1-1 gso2-1种子扭曲、高渗表型一致，且不存在加性，说明TWS1与GSO1/2在同一条通路上。

tws1的突变体.png

并且在tws1中胚胎角质层的发育也同样受损，更进一步暗示TWS1可能与GSO1/2共同调控胚胎角质层的发育。【可从上述表型，以及已有的报道中推测，因为GSO1/2的配体是与TWS1同属于硫酸化的肽】

胚胎角质层受损.png

小结一

【至此，本文通过TPST酶的突变表型，推测受该酶加工的某种肽调控该表型，于是首先猜到CIFs，但是四突没表型，于是猜测其他的，结合TWS1多肽的报道，重新敲除后确定TWS1表型。文章做到这里，一般的思路是往下验证TWS1与GSO1/2互作，共同调控表型，结束，比较常规，且同类家族的多肽CIFs与GSO1/2作为配体受体已经被报道过，新意有待提升。】
那么作者是如何往下进行思考的呢？

2、ALE1的加工对于TWS1与GSO的互作是必要的

【前文提到的ale1表型，以及领域内的背景知识：ALE1与GSO1/2在同一条通路上调控胚胎角质层的发育，并且ALE1蛋白酶是在胚乳中特异表达，那如果能够阐明ALE1的加工对于TWS1的活性是必须的，那就与这几个基因的表达部位的特异性，以及细胞分区，精确调控相关，就很有意思了。】

接下来证明TWS1能够被ALE1加工，在烟草体内，和体外纯化中证明TWS1被ALE1加工切割，并进一步细化到切割位点位于His⁵⁴ 和 Gly⁵⁵。将TWS1的这两个氨基酸突变后，TWS1将不能被ALE1切割，说明这两个氨基酸残基对于TWS1的剪切位点非常关键。并且依赖于ALE1的加工发生在TWS1的C端。【后面的几句没太懂，个人理解是，TWS1和CIFs的氨基酸序列比较来看，由于CIFs位置更靠C端，TWS1没那么靠近C端，所以TWS1的C端需要ALE1进行加工来激活TWS1的活性。】这或许可以解释同类硫酸化多肽在种子和根中发挥不同功能。

TWS1能够被ALE1加工

【既然C端ALE1的加工对于TWS1的活性是不可少的，那么N端的DY基序是否也如此呢？】
于是接下来检测TWS1的生物活性，但是由于合成的肽对于胚胎的处理是困难的，于是作者用的是在根中的CIFs的研究系统。在根中，CIFs能够引起异位的内胚层的木质化，且该过程依赖于GSO，实验发现TWS1同样具有此功能。于是通过在cif1/2双突中分别施加硫酸化后的肽、未硫酸化的肽来看硫酸化对于TWS1生物活性的影响，结果：硫酸化TWS1能够在一定程度上恢复cif1/2造成的gaps，而未硫酸化的TWS1不能。
这表明N端的硫酸化对于TWS1的生物活性不可或缺。进一步将发生硫酸化的氨基酸残疾Y³³突变，也同样展示出了与硫酸化多肽酶TPST的突变体tpst相似的表型。这更全面的说明了，TWS1的N端DY基序上由TPST酶所执行的硫酸化修饰对于TWS1的生物活性不可或缺。

TWS1活性需要N端硫酸化.png

并且在上述中，借助根的体系还暗含了在根中TWS1对于内皮层的影响是依赖于GSO1/2的。
那么接下来终于要做互作实验了【对于小肽配体与受体之间的互作，一般会通过ITC\MST\GCI，能够更高灵敏度的检测互作】。
Grating-coupled interferometry (GCI）光栅耦合干涉技术能够基于光波信号传导来提供分子间互作的动力学数据，确定亲和力常数等。实验中，显示TWS1与GSO1互作，Kd解离常数在30nM，确实比CIFs与GSO1的互作弱，这也刚好能够与体外施加恢复的程度（TWS1恢复效果不如CIF）对应的上。
并且进一步做了未硫酸化的TWS1与GSO的，进一步证实了TWS1的硫酸化对于二者互作是关键的。此外，将TWS1的C端添加3AAA【用来阻挡ALE1的切割？】，结果证明添加3AAA之后，互作变弱，用来证明C端的ALE1的加工是重要的。

小结二

通过以上三类实验，证明了：
1、TWS1被ALE1加工
2、TWS1与GSO互作
3、N端硫酸化至关重要
4、C端ALE1切割至关重要

三、TWS1在胚胎与胚乳之间穿梭

tpst 纯合突变体用野生型花粉进行授粉后，没有胚胎表型，在F1代中只有tpst x tpst展示出表型，说明该表型是合子起源【？】。

合子起源.png

TPST在种子中遍在表达，为了探索哪一个区室的TPST对TWS1产生影响，于是分别用遍在启动子 RPS5A、胚胎特异启动子 PIN1、胚乳特异启动子RGP3驱动TPST的表达。结果： RPS5A、 PIN1下均能回补，只有RGP3驱动下，不能回补，这暗示TPST对TWS1的加工在胚胎中发生。

iTPST表达.png

回补.png

并且TWS1的定位分析显示:TWS1在胚胎初期开始在整个胚胎区域表达，随后，被限制在root tip【表达pattern同样暗示了：这种前后期表达的差异非常重要】。

TWS1表达.png

TWS1随胚胎发育中表达变化.png

【那么TWS1作为信号肽在胚胎中产生，在胚胎中用TPST进行N端硫酸化加工，为什么还需要跑到胚乳中用ALE1进行C端加工，然后再跑回胚胎中与受体GSO结合，调控胚胎角质层完整性的沉积？这样穿梭的意义，或者需要在特定细胞分区之间加工的意义是什么呢？】
作者在tws1背景下转入pTWS1:ALE1，得到胚胎特异表达的ALE1，然后通过杂交引入TWS1，这样得到均在胚胎中表达的TWS1、ALE1以及GSO【为什么要在tws1背景下】。该类种子成熟时严重枯萎，但仍有部分可以发芽，说明胚胎中所有信号持续共表达会对种子发育产生负面影响，胚胎信号的持续激活，引起种子的应激基因上调。这就为上一个问题提出了解释：空间的分区或许提供了胚胎信号衰减的条件。

胚胎中共表达三者.png

应激基因上调.png

接下来，用胚乳特异启动子RGP3分别驱动CIF1、CIF2、TWS1去回补tws1和ale1的表型，发现均能回补tws1表型，这说明在胚乳空间中进行加工，再返回胚中的肽，对胚胎角质层完整性的沉积是关键的【胚乳一轮游之后的肽，是有功能的肽】。对ale1的回补，缺失C端的CIF具有更强的回补效果【缺失了C端意味着该实验中CIF不用通过ALE1等酶的加工，相比于ale1背景下ALE1缺失，无法对TWS1进行加工来看，TWS1如果完全恢复ale1的表型，说明ALE1是TWS1唯一的加工酶，如果如文章中不能完全恢复，那么还有别的酶】。

恢复情况png

小结三

以上两部分说明了：TWS1信号若在从产生到加工一直在胚胎中，即胚胎信号在胚胎中持续共表达，会引起种子应激，对种子发育有害。在胚乳中进行的加工，具有对胚胎发育/角质层沉积的调节作用。

Model

综上，作者提出，TWS1在胚胎产生，胚乳加工，再返回胚胎发挥功能，这样的双向信号传导模式能够有效地监察胚胎角质层的完整性。具体为：

胚胎产生TWS1前体，经由N端硫酸化加工后，分泌到胚胎外，通过不连续的角质层的空隙，扩散到胚乳中
在胚乳中被ALE1等酶进行C端加工，使其具有活性
活性TWS1再次经由角质层空隙回到胚胎中，与胚胎中的受体GSO1/2结合，激活下游信号通路，对角质层进行修复
直到角质层沉积完整，肽前体被限制在胚胎中，该信号逐渐衰减

模式图.png

个人总结与收获

GCI实验严谨的对照设计，小肽互作实验真的是在精不在多，全文的互作只有GCI，但GCI的各种对照结果都是很好的。相信也下功夫摸索了实验体系。
如何证明肽的移动，感觉本文对于移动的证明非常巧妙，是通过小肽发挥功能的两个关键环节下手证明，一个是小肽具有功能所必需的前体加工，二是小肽发挥功能所必需的受体。通过加工酶与受体的细胞区间定位的差异，来讲述“移动”。
一开始在cifs没有表型之后，仍然找到新的思路并做出很好的文章。

参考文献

1.https://www.science.org/doi/10.1126/science.aaz4131?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed#R1
2.https://journals.biologists.com/dev/article/140/4/770/76743/ZHOUPI-controls-embryonic-cuticle-formation-via-a
3.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5100777/
4.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8267416/
5.https://www.science.org/doi/10.1126/science.aai9057?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed

通讯lab
http://www.ens-lyon.fr/RDP/squelette/personnel-du-rdp/?lang=fr

【读文献】多肽作为双向交流信号调控胚胎发育