随着身体年龄的增长，器官功能逐渐下降，患各种疾病的风险增加，包括心血管疾病、癌症和神经退行性疾病。了解身体如何衰老是一个很火的研究领域，因为它将有可能阐明促进健康衰老（healthy aging）的方法。
今天分享另外一篇关于衰老的，做的是果蝇。自美国贝勒医学院、斯坦福大学、陈-扎克伯格生物中心和基因泰克公司（Genentech）等研究机构的人构建了一个衰老果蝇单细胞图谱（Aging Fly Cell Atlas, AFCA），对果蝇中163种不同细胞类型衰老过程的进行了详细的探索。发表在Science上，论文题目是“Aging Fly Cell Atlas identifies exhaustive aging features at cellular resolution ”。
这个文章中，作者使用果蝇作为模型生物，并采用单细胞核转录组测序技术（图1A）。他们选择了不同年龄段的果蝇，分别取样果蝇的头和身体，时间段选取幼龄的果蝇（5天），年轻的果蝇（30天）、中年果蝇（50天）和老年果蝇（70天）。雌和雄果蝇分别取样（图1B）。图1B就是每个时间点样品获取的细胞的数目，5天时候最多。
然后，作者将果蝇单细胞测序数据进行整合，并进行聚类分析。从不同时间点的对比可以看出，细胞类型的分布基本是相同的（图1C）。所有数据合并以后，作者共获得了868,000个细胞，可以分成17个不同的大细胞类型（图1D），每种细胞类型的数目如图1E所示。
作者认为细胞类型注释的正确与否是后面分析的关键。所以先用已经发表的FCA，也就是前面讲的果蝇全组织图谱来验证一下衰老图谱注释的准确性。经过对比，发现两种方法的overlap率可以达到80%以上（图2A）。接着作者有用鉴定的marker基因验证了注释的准确性。总的来说，作者得到了163个不同的细胞类型，91个来自头，72个来自身体（图2B）。
对于一些比较复杂的组织，例如大脑，当测序的细胞越多的时候，就可能会出现一些新的细胞类型。比如神经元细胞，当合并年轻的和年老的果蝇的头部数据之后，17个新的子细胞类型就被鉴定出来（图2C）。
下面作者就去探索利用AFCA图谱能否发现一些随着衰老的特异细胞类型。作者拿肠道细胞做了一个例子说明，因为它里面的体细胞干细胞谱系的衰老变化已经得到了很多的研究。在健康的年轻苍蝇肠道中，肠道干细胞通过适当的增殖维持肠道稳态以及分化。在年老苍蝇中，ISC表现出高增殖率，ISC的子细胞（EB cell）不能正确分化成为成熟的肠细胞，导致发育不良表型。所以作者把6种不同类型的肠道细胞单独拿出来做了轨迹分析（图2D）。随着分化时间，ISC和EB明显增加，并且成熟肠细胞显著减少。
然后作者查看了随着衰老的进程，细胞类型的构成上面有没有什么明显的变化。作者分别把30d，50d，70d的细胞数目和5d的进行比较。增加最多的五种细胞类型是贲门细胞（来自肠道的前胃）、脂肪体细胞，雄性副腺主细胞、EB和成体唾液腺细胞（图2E）。前胃增大细胞、雄性副腺主细胞和EB细胞和衰老相关，之前的研究已有报告，从而确认文章的数据。但是脂肪体细胞还没有类似的报道。作者接着验证了这个现象（图2F），证明了随着年龄的增长，脂肪体细胞的增多。然后作者发现，随着衰老的进程，出现多个细胞核的脂肪体细胞明显增多（图2G，2H）。在减少最多的五种细胞类型中，有三种类型的肌肉细胞——间接飞行肌内脏肌和其他肌肉细胞（主要是骨骼肌）（图2E）。肌肉力量的丧失，即肌肉减少症，是包括人类在内的不同哺乳动物的一种保守的衰老表型。作者通过体内染色数据也证实了与年龄相关的间接飞行肌的退化，以及老年苍蝇中凋亡标志物Caspase3的显著增加（图2I）。
接着，作者开始鉴定随着衰老的过程，调控的差异表达基因。还是30d，50d和70d分别和5d做对比（图3A）。为了横向差异表达基因在衰老过程中的动态变化，作者查看了变化的比率（图3B），其中30d的时候变化最显著。一些细胞类型，如雄性附属腺，在最后一个时间窗口显示出最小的变化，表明这个细胞类型在50d左右达到其最大转录组变化。5.3%的细胞类型，包括肠道干细胞和贲门细胞，在最后一个时间窗口显示出剧烈变化（＞50%的DEG），这表明它们在前50天的衰老速度较慢。其他细胞类型，如外部感光细胞和脂肪体细胞表现出稳定的变化。因此，该分析表明，不同的细胞类型以不同的衰老速率，表现出不同的基因表达变化模式（图3C）。如果画成细胞比例和DEG数目的相关图的话（图3D），发现显著影响的细胞类型有：adult fat, outer photoreceptor cell, indirect flight muscle等。
然后，作者开始对于上面挑出来的细胞类型做GO富集分析（图3E和3F），用的是50d和5d对比的差异基因。然后发现来自身体和头部的脂肪体细胞（成年大脑周围脂肪量）中上调的基因功能主要集中在，如脂质稳态和甘油三酯稳态（图3E）。对于间接飞行肌肉细胞，运动行为的退化很可能由肌肉退化引起（图3F）。
然后作者探索尝试，能不能运用这个单细胞图谱，找出能表征衰老进程的marker cell type，类似以前照marker基因一样的道理。所以用各个细胞类型和衰老进行了关联分析，简单的理解的话，类似相关性，文中用的也是R2（图4A）。其中头部和身体的外部感光细胞和酿酒细胞分别显示出最高的预测得分（图4B和4C）。不同时间点数据对比显示30d的差异最大（图D）。然后作者还尝试鉴定和衰老高度关联的衰老基因。发现大多数衰老时钟基因用于细胞类型特异性方式（图4E）。并且94个RP基因中有70个被鉴定出来作为衰老时钟基因，说明这类基因在衰老过程中的关键作用（图4E-4G）。并且对比果蝇和老鼠已知的33个基因中，31个就是RP基因（图4H）。
通过上面的分析可以看出，不同的细胞类型对能够表征不同的衰老特征。所以作者很好奇，除了基因表达之外，单细胞数据的其它特征，包括表达的基因数量或reads数量（UMI）变化以及细胞特征的一致性等特征是否也与衰老有关系（图5A）。发现约80%的细胞类型表现出随着衰老表达基因数量逐渐减少，但20%的人表现出增加的趋势，这表明衰老影响细胞中表达的基因数量，并且是与细胞类型有关的。其中有详细highlight了几个细胞类型表达基因数目的变化特征（图5C）。以往的报道表明，在衰老的过程中，细胞类型的特征会逐渐弱化，但是具体表现为什么特征还未知。在这个文中，作者用旧marker基因的减少/新marker基因的获得来衡量这个特征。然后用这个score进行排序（图5D）。发现间接飞行肌肉的marker基因Nlg1，随着年龄的增长而急剧下降，而其他年轻标记基因也是如此。还举了Chchd2的例子。
然后作者就用其它几个特征，比如：DEG（差异基因的数目），表达基因的数目，细胞的构成，细胞特征的一致性等作为可选的变量来和衰老这一变量做关联，发现DEG和细胞特征一致性相关性最好，也就是对衰老的解释率最高（图5E）。做成热图会发现，几个特征之间的一致性也是较高的（图5F），都可以对衰老进行解释。
