LGR5 marks targetable tumor-initiating cells in mouse liver cancer
在这里，我们报道了小鼠肝脏肿瘤中表达LGR5的细胞（一种公认的干细胞标志物）的富集，以及人肝细胞癌中LGR5表达的上调。从小鼠肝脏肿瘤中分离出的表达LGR5的细胞在启动类器官和移植时形成肿瘤方面具有优越性，具有候选TIC。这些细胞对包括索拉非尼和5-FU在内的常规治疗具有抗性。重要的是，LGR5谱系消融可显著抑制类器官的启动和肿瘤生长。LGR5消融与5-FU的组合，但不是索拉非尼，进一步增强了体内的治疗效果。因此，我们已经确定LGR5区室是一个重要的TIC人群，代表了对抗肝癌的可行治疗靶点。
LGR5（富含亮氨酸的重复含有G蛋白偶联受体5）作为CSC / TIC室在这方面的潜在标志物引起了特别的兴趣。LGR5是几种组织/器官中表征良好的干细胞标志物，包括小肠，结肠和肝脏4，5，6.在结肠和肠道中，LGR5干细胞池不断增殖并分化成成熟的细胞类型，以补偿功能性上皮细胞的丧失。有趣的是，这些LGR5干细胞也参与肿瘤发生过程，充当肠癌的起源细胞。7.重要的是，LGR5标记结肠癌中的CSCs。8，9，10肠癌11和基底细胞癌12.在肠腺瘤和恶性癌中，LGR5细胞始终占肿瘤细胞的5-10%，并推动肿瘤生长8，13.概念验证表明，LGR5细胞的特异性消除会延迟结肠癌肿瘤生长9.鉴于CSCs / TIC的重要作用，这些细胞是抗癌治疗的有吸引力的靶标，而它们对常规疗法的抵抗力阻碍了治疗的发展。
与结肠和肠道相反，LGR5干细胞在稳态肝脏中不存在，但在组织损伤时出现4，14.这些肝脏LGR5细胞可能是对损伤有反应的中间干细胞/祖细胞群，但它们对组织修复的贡献可能有限。14.LGR5区室是否存在于肝癌中仍然不为人知，并且这种区室在这种疾病中的可能重要性尚未得到探索。然而，迫切需要对这种可能性进行研究，因为肝癌是全球最常见的恶性肿瘤形式之一，每年报告近80万例病例，其特点是令人沮丧地缺乏治疗方案。+15.肝细胞癌（HCC）和胆管癌（CC）是原发性肝癌的两种主要类型。目前，手术仍然是唯一可用的潜在治愈性治疗策略，但以其肿瘤切除后的高复发率而闻名。化疗和靶向治疗通常无效，索拉非尼可延长肝细胞癌患者的预期寿命。肝癌的不寻常的治疗耐药性被认为与CSCs / TIC的存在有关，但这一概念在很大程度上仍未得到证实。16.因此，我们旨在研究LGR5是否在肝癌中标记CSCs / TIC，并探索这些细胞的治疗靶向的潜力。我们的结果表明，在肝癌中，存在一个在肿瘤起始方面优越的LGR5区室，并介导治疗耐药性。针对这一群体是防治这一疾病的合理途径。+
LGR5表达细胞在原发性肝肿瘤中的富集
正常稳态肝脏不表达LGR5,但是在损伤和癌症中表达，作者通过了流式和免疫荧光强度检测说明，并且LGR5可能会产生双能性CC(CK19),HCC(HNF4A)表型的癌症。
CCL4用于肝损伤，二乙基硝胺（DEN）用于诱导原发性肝肿瘤形成。
LGR5的临床相关性
但是我在TCGA数据库中发现和预后的关系不大。
肝肿瘤类器官和同种异体移植肿瘤中表达LGR5的细胞的维持。
这些类器官可以在3D培养物中维持和繁殖至少5个月。CK19和HNF4α的染色表明这些类器官显示出CC或HCC样表型（图3a，b）。重要的是，这些培养的类器官维持着LGR5阳性细胞群
LGR5细胞在类器官和肿瘤起始方面具有优势+
有趣的是，由单个LGR5-GFP或LGR5-GFP形成的类器官+−细胞产生LGR5阳性和-阴性后代，表明可能自我形成维持类器官生长和分化的分层组织
抗癌治疗丰富表达LGR5的细胞
CSCs 或 TIC 对常规抗癌治疗具有相对耐药性。因此，一个预测是，在肝癌中，与LGR5相比，LGR5细胞对抗癌治疗的抵抗力更强。+−细胞。因此，我们用FDA批准的用于治疗晚期HCC的药物索拉非尼挑战肿瘤类器官，并比较了LGR5-GFP和LGR5-GFP的相对潜力。+−细胞可以承受这种处理（图5a）。用索拉非尼治疗肿瘤类器官显着增加了群体中LGR5阳性细胞的百分比（图5b-d）。当用化疗剂5-氟尿嘧啶（5-FU）治疗类器官时，这种效果变得更加深刻（图5a-d）。
随后，评估用这些治疗剂进行体内处理后LGR5隔室的相对大小（图5e）。用索拉非尼或5-FU治疗由移植肿瘤类器官形成的携带小鼠的同种异体移植肿瘤，显着增加了肿瘤中LGR5-GFP细胞的比例（图5f）。同样当 LGR5–GFP 和 LGR5–GFP 时+++−从肿瘤类器官中分离细胞并用于类器官再开始，随后用5-FU处理，所得培养物以表达LGR5-GFP的细胞为主，与LGR5-GFP或LGR5-GFP无关。++−用作起始材料（图5g）。值得注意的是，从5-FU治疗的肿瘤中分离出的LGR5细胞保留了类器官和肿瘤启动的能力（补充图8）。有趣的是，5-FU处理有效地重新接线了LGR5细胞的转录组（图5h;补充图6和9）。与未经处理的LGR5细胞相比，对5-FU处理之间的1464个差异表达基因的基因富集分析揭示了干细胞相关途径的参与，包括“Wnt信号传导”，“缺口信号通路”，“ErbB信号通路”，“刺猬信号通路”和“BMP信号通路”（图5i;补充数据 3）。这些通路通常在许多类型的实体瘤中被激活，与癌症的发生、进展和转移有关。+++23.有趣的是，有几种途径，包括“TGF β信号通路”，“EGFR1信号通路”，“PPAR信号通路”，“G1至S细胞周期控制”，“错配修复”，“p53信号传导”和“细胞凋亡调节/凋亡通路”，已知它们与抗癌治疗反应和DNA损伤反应有关24.这些结果可能部分解释了5-FU处理后表达LGR5细胞的富集。总之，除了耐药性外，传统的抗癌治疗还触发了表达LGR5的细胞的产生和繁殖。
LGR5谱系消融抑制类器官和肿瘤生长
我们推断LGR5室的消融应该会损害肝癌的生长。为了实验测试这一概念，我们利用了Lgr5-DTR-GFP小鼠中白喉毒素受体（DTR）的共同表达。这将使我们能够通过白喉毒素（DT）给药专门耗尽Lgr5-DTR-GFP区室（图1a）。我们已经优化了针对LGR5消耗的DT处理（1-10 ng / ml）的浓度，其类器官来自健康的Lgr5-DTR-GFP小鼠++14.因此，我们评估了对类器官启动和增殖的影响（图6a，b），索拉非尼治疗作为阳性对照。DT治疗抑制了肿瘤类器官的生长，其效果显示出与LGR5-GFP细胞数量的影响密切相关（图6c-e）。DT治疗不影响遗传野生型肿瘤类器官的生长（图6c：左图）。+ 然后作者还做了治疗后的流式检测，肿瘤体积和重量测量。
联合治疗增强抗癌功效
由于LGR5细胞似乎介导了对常规抗癌治疗的耐药性，因此评估LGR5谱系消融与常规抗癌治疗的结合是合理的。++
为了实验测试这一概念，我们首先将DT与索拉非尼治疗相结合。然而，使用不同的联合治疗策略，在同种异体移植肿瘤上未观察到增强的抗肿瘤活性（图7）。接下来，我们测试了5-FU和DT的组合。首先对同种异体移植物荷瘤小鼠进行5-FU（增加LGR5室的相对大小），然后停止5-FU治疗并开始DT治疗以杀死LGR5细胞（图8a;补充图13a–c）。事实上，这种方法在对抗同种异体移植肿瘤形成方面是有效的（图8b），并且大大优于使用5-FU，独立DT治疗的单一疗法（图8c，d;补充图14a）或DT的初始治疗，然后进行5-FU治疗（补充图13d-h）。同时施用5-FU和DT（图8e）也产生了抗癌作用（图8f-h;补充图14b）。因此，靶向LGR5区室显着增强了旨在对抗肝癌的常规治疗的疗效。+++
和索拉菲尼联合治疗不能增强疗效
和5-FU联合治疗增强疗效
收获
LGR5作为肠癌、肠干细胞的标记物已经被广泛报道，但LGR5在肝癌中的作用，是否可以作为肝癌干细胞的标记物还不知道，作者对LGR5示踪很好的观察到了LGR5作为肝癌起始细胞可进行双向分化，并且在体内不对称分裂成为干细胞和非干细胞，干细胞的比例减少，并且也符合癌干细胞耐药性的特点，证明了肝癌含有一个LGR5区室，该区室具有TICC / CSCs的各种特征。并且利用白喉毒素谱系治疗和联合治疗达到不错的效果。我们自己分析的肝癌干细胞高表达的一些基因也可以做一些类似的工作来进行证明。因为分析到的一些转录因子也是和肠癌干细胞有关的，而肝癌报道很少，说明同样的marker只要在肝癌中没有报道和干性相关，那还是可以做的。
