Clinical and molecular characteristics of COVID-19 patients with persistent SARS-CoV-2 infection | Nature Communications
https://www.nature.com/articles/s41467-021-23621-y#article-info
影响因子： 12.121PMID：34108465
期刊年卷：Nat Commun 2021 06 09;12(1)
综合性期刊二区 综合性期刊 Q1 3/64
DOI：10.1038/s41467-021-23621-y
摘要
具有持续性 SARS-CoV-2 感染的 COVID-19 患者的特征尚未得到很好的描述。在这里，我们比较了病毒脱落持续时间长 (LDs) 患者与病毒脱落持续时间短的患者 (SDs) 和健康供体 (HDs) 患者的临床和分子特征。我们发现几种细胞因子和趋化因子，如白细胞介素 (IL)-2、肿瘤坏死因子 (TNF) 和淋巴毒素 α (LT-α) 在 LD 中的含量低于 SD。单细胞 RNA 测序显示自然杀伤 (NK) 细胞和 CD14 +LDs 中单核细胞减少，而调节性 T 细胞增加；此外，LDs 中的 T 和 NK 细胞比 SDs 中的活化更少。重要的是，LDs 中的大多数细胞显示核糖体蛋白 (RP) 基因和相关通路的表达降低，RP 水平与感染持续时间之间的这种反向相关性在 103 名独立患者中得到进一步验证。因此，我们的结果表明免疫抑制和低 RP 表达可能与 COVID-19 患者病毒感染的持续存在有关。
在此，我们检查了 38 个 SD、12 个 LD 和 22 个 HD 中的 48 种血清细胞因子/趋化因子水平。此外，还收集了来自 3 个 HD、9 个 SD 和 5 个 LD 的新鲜 PBMC，并进行了 10x Genomics 单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)，以剖析和比较与持续病毒感染相关的潜在变化。我们发现几种细胞因子/趋化因子（IL-2、TNF 和 LT-α）在 LD 中的含量低于 SD。单细胞 RNA 测序表明 LD 中的免疫抑制状态和低 RP 基因表达。此外，我们提供了一个资源来揭示持续感染 SARS-CoV-2 的 COVID-19 患者的临床和分子特征，这可能对理解和控制 COVID-19 具有重要意义。
结果
样本特征
病毒脱落的持续时间被定义为从发病直到连续阴性检测SARS-CoV的-2 RNA的，具有COVID-19的其他研究一致的间隔19，20。截至 2020 年 4 月 30 日，共有 12 名非危重 COVID-19 住院患者表现出长时间的病毒脱落（> 45 天）。鉴于 SARS-CoV-2 病毒排出持续时间的中位数约为 3 周21，我们还收集了 38 名年龄和性别匹配的非危重 COVID-19 住院患者，其病毒排出持续时间 <21 天以进行比较（补充表 1）。所有患者均被确认为中国武汉同济医院实验室确诊的 SARS-CoV-2 感染患者。LDs 和 SDs 的中位病毒脱落持续时间分别为 57 天（范围：45-100 天）和 16 天（范围：3-21 天）（对数秩p < 0.0001）（补充表 1）。这些患者的基本人口统计学信息和临床参数比较详见补充表 1. 值得注意的是，LDs 和 SDs 在合并症、全血细胞计数（白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、血小板计数和血红蛋白）、血液生化（丙氨酸/天冬氨酸氨基转移酶和乳酸脱氢酶）和凝血功能方面没有显著差异（凝血酶原、活化部分凝血活酶时间和 D-二聚体）。此外，炎症标志物，如降钙素原、红细胞沉降率 (ESR) 和 c 反应蛋白 (CRP)，已被广泛报道为发生严重 COVID-19 的高危因素22 , 23 , 24, 在 LD 和 SD 中也具有可比性。因此，迫切需要进一步调查以确定病毒排放持续时间的新指标和持续病毒排放的潜在机制。
SD、LD 和 HD 中的细胞因子
细胞因子是 COVID-19 病理生理学的核心，“细胞因子风暴”被描述为 COVID-19 严重程度的一个特征，这与不良结果相关25 , 26。为了进一步阐明与病毒脱落持续时间相关的免疫反应，我们检查了 38 个 SD、12 个 LD 和 22 个 HD 中的血清细胞因子/趋化因子水平。有趣的是，在检测到的 48 种细胞因子/趋化因子中，与 SD 或 HD 相比，21 种炎性细胞因子/趋化因子在 LD 中的水平最低（图 1c）。其中，血小板衍生生长因子 (PDGF-BB) ( p = 0.000065)、CC 基序配体 5 (CCL5) ( p = 0.00011) 和巨噬细胞迁移抑制因子 (MIF) ( p = 0.00015) 显示出最显著的变化（图 1c和补充图 1）。此外，IL-1β，IL-2，IL-2R，IL-9，IL-18，TNF和LT-α，其中的上调促成肺损伤，多器官衰竭，并最终导致死亡27，28，29，在 LD 中以较低水平存在（图 1c）。总的来说，持续的病毒脱落与较弱的炎症反应有关，其特征是细胞因子和趋化因子的循环浓度低。
图 1：LD 和 SD 中的病毒学、临床和细胞因子/趋化因子特征
a采用 Kaplan-Meier 方法估计病毒 RNA 的阳性率，并应用双边对数秩检验评估 LDs（n =12）和 SDs（n =12）中病毒脱落持续时间的显著性差异（n = 38）。
b从LDs（n = 12）和SDs（n = 38）的临床记录中获得的C反应蛋白（CRP）值以及从LDs（n = 10）和SDs（n = 10）的临床记录中获得的红细胞沉降率（ESR）值（n = 38）。箱线图显示了中位数（中线）以及第一和第三个四分位数（箱），而胡须显示箱上下的四分位距 (IQR) 的 1.5 倍。进行了非配对双尾学生t检验。
c来自 HDs ( n = 22)、LDs ( n = 12) 和 SDs ( n = 38) 被收集，并进行测定以测量 48 种细胞因子/趋化因子的浓度，其中显示了 20 种具有统计学意义。Y轴代表细胞因子浓度(pg/ml)。箱线图显示了中位数（中线）以及第一个和第三个四分位数（框），而胡须显示了框上方和下方 1.5 倍的 IQR。进行单边 Wilcoxon 秩和检验。
源数据作为源数据文件提供。
SDs、LDs和HDs中PBMCs的细胞组成差异
为了表征 LDs 和 SDs 与 HDs 相比的免疫学特征，我们进行了 10x Genomics scRNA-seq 以研究来自 3 个 HDs、9 个 SDs 和 5 个 LDs 的 PBMCs 的转录组谱（补充表 2）。这些患者的人口统计学、临床特征和实验室检查结果列于补充表 2 中。在统一的单细胞分析管道（参见方法）之后，来自所有受试者的总共 167,946 个细胞（每个样本平均 9879 个细胞）被整合到一个非批处理和可比较的数据集中（补充表 2）。根据之前的报告30，我们没有在这些患者的 PBMC 中检测到 SARS-CoV-2 RNA 表达（补充图 2）。
使用统一流形近似和投影（UMAP）的无监督聚类，我们根据典型细胞类型基因标记的表达鉴定了 20 个细胞群（图 2a-b，补充图 3）。为了揭示 LD 和 SD 细胞组成的差异并将它们与 HD 的细胞组成进行比较，我们研究了三组中免疫细胞的相对比例（图 2c-d）。LDs中NK细胞的比例显著降低（图 2d）。CD14 +单核细胞在 LDs 中最低，与 SDs 相比，LDs 显示出略微显著的下降趋势（p = 0.06）。值得注意的是，据报道，由 T 细胞诱导的炎性单核细胞会引发 COVID-19 中的细胞因子风暴31。LDs中 NK 细胞和 CD14 +单核细胞的大量减少与观察到的 LDs 中炎性细胞因子的减少一致32。此外，三组LDs中Treg的比例显著最高（图 2d）。鉴于 Treg 在分泌免疫抑制细胞因子和抑制先天性和适应性免疫细胞活化方面的重要性33 , 34，统计上显著升高的 Treg 水平可能有助于抑制 LDs 中观察到的免疫反应。综合来看，NK细胞和CD14 +单核细胞呈下降趋势，Treg升高可能与免疫抑制状态和病毒在LDs中的持续存在有关。
图 2：PBMC 单细胞转录组的细胞组成差异
a163,498 个单细胞UMAP 图，按从 HD（n = 3）、SD（n = 9）、LD（n = 5）识别的细胞类型着色。
b 20 个聚类中的小提琴图显示的选定规范标记的表达分布。
c在单个样品水平上每种细胞类型的比例。
d每组中每个细胞簇比例的箱线图。HD（n = 3）、SD（n = 9）、LD（n = 5）以不同颜色显示。水平线代表中值，最大值为 1.5 × 四分位距。在每组之间进行单边 Wilcoxon 秩和检验。源数据作为源数据文件。
与 LD 相关的转录签名
接下来，我们根据 HDs 的相对基因表达变化进行层次聚类，以评估 LDs 和 SDs 中每种细胞类型的分子差异。出乎意料的是，除了血浆 B 细胞和巨核细胞外，PBMC 中的所有细胞类型都根据疾病组而不是细胞类型聚集在一起（补充图 4））。这表明 LDs 和 SDs 中 PBMC 的分子特征明显不同，无论细胞类型如何。因此，我们试图通过差异表达基因 (DEG) 和基因肿瘤学 (GO) 分析来确定单个细胞类型中相关生物学功能的变化。最重要的是，我们发现靶向膜的蛋白质、内质网 (ER) 相关通路和翻译相关通路在 LD 的所有细胞类型中均持续下调，除了 γδ (γδ) T 细胞、黏膜相关不变 T细胞（MAIT）和巨核细胞（图 3a）。与GO分析结果一致，许多编码RP和免疫相关基因的基因在LDs中被特异性下调（图 3b-c）。特别是，RPL41、RPS29、RPL36A、RPS27、RPS21、RPS10、RPL38、RPL39 和 RPS28 定位于 ER 并参与蛋白质合成、折叠和组装，详见https://www.proteinatlas上提供的信息。组织。TMA7 35、TAF10 36和PTOV1 37在LDs 中也被特异性下调。先前已报道这些基因与核糖体相关，并且它们的过度表达促进全局蛋白质合成。鉴于抗体38和细胞因子39由粗糙的 ER 和附着的核糖体合成、折叠、修饰和组装，这些发现表明 LD 的免疫细胞往往具有减少的细胞因子合成、折叠和组装功能，这与观察到的较低水平的炎性细胞因子一致LD（图 1c）。参与促炎细胞因子产生的 CEBPD 和 MAP2K2 以及参与 IL-2 产生的RAC1 40在 LD 中选择性减少（图 3b-c）。此外，LDs 中参与 T 细胞活化（PCBP1、ARPC2）、迁移（FMNL1）、细胞毒功能（GNLY、SRM）、转录因子（LYN）和下游信号转导（COTL1）的基因都减少了（图 3b-c）。鉴于细胞因子是由几种免疫细胞产生的，包括适应性 T 细胞41，这些发现至少部分解释了 LDs 中细胞因子水平的降低。
图 3：与长病毒脱落持续时间相关的转录特征
a在细胞类型分辨率下，LDs 和 HDs 之间下调基因富集GO 通路。由核糖体基因富集的通路用红色标记。颜色强度表示富集p值，点大小表示每个途径中基因富集的比例。
b 17 个样本中所选基因的表达水平。颜色强度表示相对表达水平。
c在细胞类型分辨率下组间选定基因的表达。颜色强度表示相对表达水平，点大小表示每个基因表达的细胞比例。点图下方的颜色条表示该组。
d103 名 COVID-19 患者全血批量 RNA 中核糖体基因的表达水平。颜色强度表示相对表达水平，热图下方的颜色条表示疾病组，散点表示 COVID-19 的持续时间。
e左：103 名 COVID-19 患者中选定核糖体基因的表达水平与 COVID-19 的持续时间之间的相关性（95% 置信区间）。右图：103 名 COVID-19 患者中三组所选基因表达水平的箱线图（G1：n = 52；G2：n = 38；G3：n = 13）。水平线代表中值，最大值为 1.5 × 四分位距。三组之间的差异通过单侧 Wilcoxon 秩和检验进行。源数据作为源数据文件提供。
此外，为了更好地支持观察结果的普遍性，我们进一步重新分类、过滤了最近一项研究42 中已发表的 scRNA-seq 数据。符合以下标准的新鲜PBMC患者纳入分析：（1）HDs：对照组；(2) SDs：症状出现后21天内且已处于恢复期的天数；(3) LDs：发病超过45天后症状仍在发展。最后，选择了 38 名 COVID-19 患者（20 个 HD、16 个 SD 和 2 个 LD）的数据进行分析。由于 LD 中的样本只有 T 细胞数据（通过流式细胞术（CD3 +))，我们在这部分数据分析中比较分析了T细胞。使用 UMAP 的无监督聚类，鉴定了基于经典细胞类型基因标记表达的 9 个细胞群（补充图 5a-c）。与我们的结果一致，GO 分析表明，在 LD 中几乎所有 T 细胞亚型中，靶向膜的蛋白质、ER 相关途径、翻译相关途径和免疫反应途径始终被下调（补充图 5d）。这些结果共同支持LDs中细胞因子的合成、折叠和组装功能可能会减少。
为了进一步评估核糖体蛋白 (RP) 水平与病毒脱落持续时间之间的关联，我们整合了来自 103 名独立 COVID-19 患者的大量 RNA-seq 数据。值得注意的是，我们发现 RP 的较低表达与较长的病毒脱落持续时间相关，包括在 scRNA-seq 数据中鉴定的以下 RP：RPL38、RPL41 和 RPS10（图 3d-e）。总之，RP 水平与病毒脱落持续时间呈负相关。是否可以应用特定的 RP 作为持续病毒感染的指标，值得进一步探讨。
LDs 和 SDs 中 T 和 NK 细胞的分子特征
接下来，我们进行的T细胞和NK细胞亚聚类分析考虑其重要的抗病毒效果43，44。来自所有样品的 T 和 NK 细胞的 UMAP 嵌入确定了 CD4 + T、CD8 + T、NKT 和 NK 细胞的细胞表型的显著差异（图 4a-b）。此外，相关矩阵显示两组之间的分子特征不同（图 4c），例如记忆 CD8 + T 细胞和 NK 细胞。
图 4：T 和 NK 细胞的亚聚类分析
aT 和 NK 细胞UMAP 投影。每个点对应一个细胞，按细胞类型着色。
b 12 个细胞簇中典型标记的 UMAP 图。数据根据对数缩放的表达水平着色。
c使用 T 细胞和 NK 细胞疾病组之间标准化转录组的 Pearson 相关系数 (PCC) 进行分层聚类。
颜色强度表示 PCC，热图上方的颜色条表示细胞类型和疾病组。
例如，在记忆 CD8 + T 细胞中，参与 T 细胞激活的 DEG（SELENOK、FYN、CCL5 和 RNF125）、细胞因子产生的正调节（IRF1、SELENTOK 和 HMGB2）、促炎分泌介质和 IFN- γ 通路（IRF1、HLA-DRB1、CCL5 和 CCL4）在 LD 中特异性下调，而与 HD 相比，它们在 SD 中上调（图 5a-b）。
图 5：LD 和 SD 中 T 细胞的分子特征
a记忆 CD8 + T 细胞中 COVID-19 组富集 GO 通路（顶部 2 列：LD 和 SD 之间的 DEG，底部 4 列：SD 和 LD 与 HD 相比的 DEG。由 SD 上调基因富集的通路用红色标记。颜色强度表示富集p值，点大小表示每个通路中基因富集的比例
b样本水平的记忆 CD8 + T 细胞中 DEGs 表达的层次聚类。颜色强度表示每个基因的相对表达。
c， d T细胞并且在三组不同的细胞类型的分辨率的克隆状态百分比。
e 三组中所选克隆类型的百分比。源数据作为源数据文件提供。
鉴于 Treg 在抑制先天性和适应性免疫细胞活化方面的重要性32 , 45。除了比较 Treg 的数量（图 2d），我们进一步计算了它们的调节得分（参见方法），并且三组之间 Treg 的功能得分没有变化（补充图 6a）。相反，CD8 +细胞毒性 T 淋巴细胞在细胞介导的针对病毒感染靶细胞的细胞毒性中起关键作用46. 提出了另一种可能性，即免疫抑制 LDs 可能具有更多耗竭的细胞。因此，我们开发了耗竭评分来评估三组细胞毒性 T 细胞的耗竭（参见方法）。值得注意的是，LDs 中的细胞毒性 T 细胞显示出显著最高的耗竭分数（补充图 6b）。再一次，升高的 Treg 计数和耗尽的细胞毒性 T 细胞可能与免疫抑制状态和 LD 中病毒脱落的持续性有关。
接下来，我们从 TCR 测序数据重建了 T 细胞抗原受体 (TCR) 序列。简而言之，除了 γδT、NK 和 NKT 亚群外，所有亚群中超过 70% 的细胞具有匹配的 TCR 信息（图 5c）。与 HD 相比，COVID-19 患者的克隆扩增明显，尤其是病毒脱落 SD 患者（图 5d）。与上面显示的 T 细胞和 NK 细胞免疫激活减少一致，主要在 LD 中的细胞毒性细胞中的大克隆扩增（克隆大小 >30）的比例很低（图 5d）。
为了探索 SD 和 LD 中优先的 V 和 J 组合，我们首先分析并列出了所有样本中 TCR 中最常观察到的 V 和 J 组合（图 5e）。在这些组合中，HD中TCR相对频繁的配对是TRBV28::TRVJ2-7和TRAV29/DV5::TRAJ20，而TRAV29/DV5::TRAJ49和TRBV9::TRBJ1-3在LD中频繁出现，而TRAV17:: TRAJ48 和 TRBV15::TRBJ2-5 在 SD 中很常见（图 5e）。V(D)J 基因的选择性使用表明，不同的免疫优势表位可能驱动 T 细胞反应的分子组成，并可能与长期或短期病毒感染有关。
此外，在 NK 细胞中，与 SDs 相比，与 T 细胞活化途径（ZFP36L2、KLF2、IRF1、LYN、RAC1、JUNB 和 CXCR4）的正调控相关的 DEGs 也显著减少了 LDs（图 6a-b） . 总之，这些结果表明 T 细胞和 NK 细胞免疫激活减少，支持 LD 的免疫抑制状态。
图 6：LD 和 SD 中 NK 细胞的免疫学特征
a NK 细胞中 COVID-19 组富集的 GO 通路（前 2 列：LDs 和 SDs 之间的 DEG，底部 4 列：SDs 和 LDs 与 HDs 相比的 DEGs。由 SDs 上调基因富集的通路用红色标记。颜色强度表示富集p值，点大小表示各通路中基因富集的比例b NK细胞中DEGs在样本水平上的表达层次聚类，颜色强度表示各基因的相对表达量。
LDs中B细胞亚群的特征
一些 T 细胞和细胞因子促使 B 细胞成熟，这些细胞会继续成为浆细胞并产生病原体中和抗体47。我们根据典型 B 细胞标记物的表达和分布将 B 细胞亚群分为三个子集（补充图 7a-b）。与 HD 相比，SD 中的血浆 B 细胞没有显著增加，这可能是由于恢复期48期间的采样（补充图 7a，图 2d）。在LDs中，尽管病毒持续存在，但浆细胞的比例也极低，这可能表明LDs未能产生足够的中和抗体（补充图 7a，图 2d））。之前的研究6、49表明，浆细胞在最初接触 SARS-CoV-2 时产生的抗体会在几周内消失，但记忆 B 细胞会持续更长时间。因此，我们比较了三组记忆 B 细胞的表达谱。有趣的是，参与 T 细胞分化（CD83、ZFP36L2 和 GPR183）以及细胞生长和激活（CD83、ZFP36L2、GPR183 和 PELI1）的通路在 SDs 中选择性富集，但在 LDs 中没有，表明 LDs 中的 B 和 T 细胞可能无法协同清除病毒（补充图 7c-d）。此外，RAC1 和 PDE4B 积极调节细胞因子（如 IL-2）的产生，以及参与白细胞趋化性的途径（LYN、DUSP1 和 RAC1）专门富含 SD（补充图 7c-d）。
