三代全长测序由于其长读长，无需组装，在转录本的结构分析具有优势，但由于成本限制，其数据量通常无法达到定量水平；二代测序可以进行差异表达定量，但因为其读长较短，且需要拼接，导致许多结构相关测序不准确。三代全长测序和二代测序的联合运用，同时解决定量和结构分析准确性两个研究中的关键问题。下面精选了近期发表的三+二转录组文章，为大家提供三+二转录组的研究思路参考。
一、凤仙花抗对霜霉病抗性研究
文章题目：Integration of early disease-resistance phenotyping, histological characterization, and transcriptome sequencing reveals insights into downy mildew resistance in impatiens
研究结果：凤仙花霜霉病（IDM）是由专性寄生卵菌引起的破坏性病害，严重威胁凤仙花的健康。因此 研究一个系统以达到揭示植物与病原菌在感染早期的交互作用和快速评估植物对IDM的抗性具有重要意义 。本研究中，研究人员调查了不同品种凤仙花对IDM的抗性。以子叶和真叶为主要研究对象，通过组织学特征初步建立了一套快速筛选抗IDM凤仙花品种和植物与病原菌互作研究的系统，发现了不同时期对IDM具有抗性的凤仙花品种，并整合二代转录组和三代全长转录组数据，构建第一个凤仙花参考转录本；同时进行比较转录组分析，发现了抗IDM的候选基因。本研究通过抗病表型、组织学特征和转录组数据的联合分析，构建了植物与病原互作模型，为后续提高凤仙花对IDM的抗性奠定基础。
二、甘蔗分蘖发育的分子研究 【 不同发育阶段 】
文章题目：Characterization of full-length transcriptome in Saccharum officinarum and molecular insights into tiller development
研究结果：甘蔗的育种工作正在广泛进行，但其平均产量远远低于理论潜力。分蘖是甘蔗产量的重要组成部分，但甘蔗分蘖发育的机制尚不清楚，且甘蔗基因组研究较为有限，阻碍分子生物学对其进一步研究。本研究基于三代全长测序得到甘蔗全长转录组，同时通过二代测序技术对甘蔗分蘖的不同发育阶段进行测序，进一步分析甘蔗分蘖发育的关键基因和生物学途径。二代和三代测序发现了大量发生在叶片和分蘖样本中的选择性剪接事件并预测到了许多异构体，通过与现有甘蔗转录本比对还发现了许多未报道的同源异构体，此外还通过转录本和lncRNA对简单重复序列（SSR）进行了鉴定。本研究丰富了甘蔗现有的基因组数据，并通过整合二代和三代测序数据发现了影响甘蔗分蘖发育的重要基因，对这些基因的进一步研究将为甘蔗生产力提升提供前景。
三、青海湖裸鲤转录组特征和复杂性研究
文章题目：Characterization and complexity of transcriptome in Gymnocypris przewalskii using single-molecule long-read sequencing and RNA-seq
研究结果：青海湖裸鲤具有适应极端高原环境的能力，是研究进化生物学的理想生物材料。然而，由于缺乏良好注释的参考基因组，限制了其在分子遗传学的进一步研究。为了研究其转录组特征，本研究使用二代转录组和三代全长转录组对其进行测序分析。通过整合二、三代测序数据，本研究鉴定出了第一个青海湖裸鲤特异的全长转录本，并通过NR、GO、KEGG、KOG和Swiss-Prot数据库进行了注释，并结合二代测序数据得到了基因表达谱。此外本研究还鉴定出了大量可变剪接事件（AS）、SSR以及lncRNA。本研究得到了比之前报道的转录本更加准确的青海湖裸鲤转录本，为进一步研究青海湖裸鲤适应高原环境的潜在遗传机制及其种群相关研究提供了重要且有价值的依据。
四、菜蛾盘绒茧蜂性别差异研究 【 不同性成熟阶段雄性和雌性 】
文章题目：Comparative Transcriptome Analysis Reveals Sex-Based Differences during the Development of the Adult Parasitic Wasp Cotesia vestalis (Hymenoptera: Braconidae)
研究结果：小菜蛾是十字花科作物的主要害虫，菜蛾盘绒茧蜂是控制小菜蛾种群的重要生物防治手段。虽然菜蛾盘绒茧蜂基因组已经被报道，但其 与性发育相关分子机制还未全面研究。本研究中，研究人员结合二、三代测序技术 对不同性成熟阶段雄性和雌性菜蛾盘绒茧蜂进行测序分析。对比于已经公布的转录本，本研究利用三代测序的优势鉴定出了许多新转录本和lncRNA，其中许多lncRNA显示出不同性别和不同阶段的。整合二、三代测序数据，发现在多个基因中出现了选择性剪接事件。此外，本研究在菜蛾盘绒茧蜂中鉴定出了多个性别决定基因，且进一步验证了它们的性别特异性选择性剪接图谱。本研究为进一步研究菜蛾盘绒茧蜂发育和性别分化奠定了基础。
五、被子植物和裸子植物不同木材形成机制研究【不同物种】
文章题目：Integration of early disease-resistance phenotyping, histological characterization, and transcriptome sequencing reveals insights into downy mildew resistance in impatiens
研究结果：裸子植物和被子植物树种之间的茎结构和细胞类型的巨大差异，导致其木材物理和机械属性出现显著不同，但是不同木材形态背后的分子机制仍不清楚。本研究挑选被子植物和裸子植物中木材产出典型树种（杨树和松树）进行研究，使用二、三代测序技术对样本的木质部、韧皮部和树叶样本就行测序分析。研究了不同物种间差异基因、特异表达基因和 AS 情况。对差异基因进行筛选，并进行GO和KEGG分析，得到关键差异路径，以此分析不同种间的基因分布和基因表达模式。通过 比较这两种植物不同的木材生成途径，揭示了被子植物和裸子植物木材形成过程的不同。在此基础上，建立了加权基因共表达网络分析（WGCNA），构建了两个树种间的木材形成共表达网络。同时通过比较木材形成相关基因的选择性剪接事件，表明被子植物和裸子植物也存在不同的转录后调控机制。本研究为后续深入研究裸子植物和被子植物不同的木材形成机制提供了基础。
总 结
可以发现上述文献研究中，均是结合二代转录组测序和三代全长转录组测序技术，利用二者优势，在定量和测序准确性取长补短，得到高质量产出，从而为研究提供助力。在研究遇到无参考基因组或参考基因组注释结果不佳时，三代转录组测序构建完整的参考转录本集，二代转录组测序找到差异基因，三+二联合分析获得差异基因转录本结构信息；在研究可变剪接、多聚腺苷酸化等情况下，三代测序得到全长转录本信息，提升基因组注释，二代转录组测序找到差异基因，三+二联合分析获得差异基因转录本结构信息。
参考文献：
[1] Peng Z,He Y,Parajuli S, et al.Integration of early disease-resistance phenotyping, histological characterization, and transcriptome sequencing reveals insights into downy mildew resistance in impatiens[J].Hortic Res,2021,8(1):108.
[2] Yan H,Zhou H,Luo H, et al.Characterization of full-length transcriptome in Saccharum officinarum and molecular insights into tiller development[J].BMC Plant Biol,2021,21(1):228.
[3] Li X,Wu J,Xiao X, et al.Characterization and complexity of transcriptome in Gymnocypris przewalskii using single-molecule long-read sequencing and RNA-seq[J].DNA Res,2021,28(3).
[4] Zhou Y,Yang P,Xie S, et al.Comparative Transcriptome Analysis Reveals Sex-Based Differences during the Development of the Adult Parasitic Wasp Cotesia vestalis (Hymenoptera: Braconidae)[J].Genes (Basel),2021,12(6).
[5] Li H,Chen G,Pang H, et al.Investigation Into Different Wood Formation Mechanisms Between Angiosperm and Gymnosperm Tree Species at the Transcriptional and Post-transcriptional Level[J].Front Plant Sci,2021,12:698602.
