Oligo7引物分析评价和筛选流程
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Oligo7引物分析评价和筛选流程
打开Oligo7软件，点击File>NewSequence，将序列粘贴到NewSequence中的空白区域，并点击√后，出现图2对话框。
点击上方菜单栏中的Edit>ForwardPrimer，并在下图红色方框中输入所设计的正向引物序列，并点击√。
点击上方菜单栏中的Edit>ForwardPrimer，并在下图红色方框中输入所设计的正向引物序列，并点击√。
至此，基因序列信息，引物信息已编辑完毕。在sequence中可以查看到已存的基因序列和引物序列的信息。接下来开始引物序列分析评价。
选择一条引物，点击上方“Analyze”，然后点击“Keyinfo”内的“Selected Primers”，会弹出两条引物的序列和其他概括信息如图6。其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物3’端的ΔG。3’端的ΔG过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。这里需要确保|3’△G|≤9kcal/mol，以防止在错配位点形成双链结构引起DNA聚合反应。
点击Analyze>DuplexFormation，分别依次选择Forward Primer和Reverse Primer进行正向引物和反向引物与基因序列间的二聚体分析。
Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其ΔG值应该偏低，，确保△G≤4.5kcal/mol，hydrogen bonds≤3。
点击Analyze>Duplex Formation>Mixed Oligos，进行正向引物反向引物间二聚体分析，如图8。一般不要使其△G≤4.5kcal/mol，hydrogen bonds≤3。
点击Analyze>HairpinFormation，分别依次选择ForwardPrimer和ReversePrimer进行正向引物和反向引物的发夹结构分析如图9所示。一般不要使其△G≤4.5kcal/mol，hydrogen bonds≤3。
点击Analyze>Composition&Tm，分别依次选择Forward Primer和Reverse Primer进行正向引物和反向引物的碱基组成和Tm值分析如图10所示。
分析结果会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，TM值可以控制在50～70度之间。
注意：按规矩需要控制上下游引物GC含量在40%-60%，上下游引物GC含量也不可以差太大，但其实实际中，引物GC含量70%我也扩成功过，上下游引物GC含量差10%也可以做，所以请根据自己实际情况抉择，在Oligo7里分析的结果给出的参数很多，你只要看我图10左里红圈的两个参数即可。
点击Analyze>False Priming Sites，分别依次选择Forward Primer和Reverse Primer进行正向引物和反向引物的错误引发位点分析如图11所示。
False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo详细，并且oligo会给正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。有研究说False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。个人感觉实践中意义不大，因为往往正确概率很高如图11右，错误概率即使达到130问题也不大，所以大家这里自己抉择吧。
点击Analyze>Internal Stability，分别依次选择Forward Primer和Reverse Primer进行正向引物和反向引物的内稳定性分析如图12所示。
Internal stability也很重要，最好是中间高两边低的弧形。这样的引物稳定性高，成功概率更高，其实实践中如果做不到问题也不是很大。
点击Analyze>PCR，即可进行PCR结果分析如图13所示。
如果你的引物有太明显的问题，在这个界面的“Comments”下方白框里会出现如图13的红字提示，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且ΔG值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。那么你就需要根据提示修改或者更换引物。如果没有，则会和图13左“Comments”内为空白。
注：在PCR栏，感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。
点击File>Print/Save Options，出现Print/Save Options对话框，进行保存信息的选择编辑。如图14所示。
在红色方框Print/Save方框下面有3中选择。Current：默认结果输出或保存；Selected：选择分析的结果进行输出或保存，可以选择自己所需要的数据结果进行保存；AllOpened：对已打开窗口中的结果进行输出或保存，选择AllOpened后，下方的Exclude栏就变得可选择，根据需要进行数据结果的保存；完成之后点击下方的OK，然后点击File>Print，打印成PDF文件。
