引言

完成载体顶层设计与克隆策略选择后，实验的核心便转向“落地执行”——如何将设计方案转化为功能稳定的重组质粒？

实操中，sgRNA设计不当、酶切星号活性、连接摩尔比失调、菌落PCR假阳性等问题，往往让研究者耗费大量时间却收效甚微。而即便获得阳性克隆，测序突变、内毒素残留等隐患，仍可能导致后续实验失败。

那么今天我们就以经典lentiCRISPRv2载体为例，详解CRISPR/Cas9基因编辑质粒的完整构建流程，拆解关键操作的“魔鬼细节”与避坑指南，同时建立从测序验证到去内毒素的质量控制闭环，帮你避开实操陷阱，确保构建的质粒“合格且好用”。

01 实战演练 —— CRISPR/Cas9基因编辑质粒构建

对于靶点研究而言，利用CRISPR进行基因敲除（KO）或激活（CRISPRa）是日常操作。我们以经典的lentiCRISPRv2（单载体双系统：同时表达Cas9和sgRNA）为例，详解构建流程。

sgRNA的设计与Oligo合成

不要盲目选择sgRNA，设计的质量直接决定剪切效率，其核心目的是确保sgRNA能高效、特异性识别靶基因，同时适配载体酶切位点，为后续插入载体做准备。

▶ 工具推荐：使用 CHOPCHOP, CRISPR Design Tool或 Benchling。

▶设计原则：

1.On-target Score：优先选择分数高的序列（通常>0.6）。

2.Off-target Score：检查是否有位于外显子区域的潜在脱靶位点。

3.G的偏好：U6启动子转录起始位点偏好鸟嘌呤（G）。如果设计的20bp sgRNA首位不是G，务必在 5' 端额外加一个 G（即变成 21bp: 5'-G-N20-3'），这能显著提高转录效率。

▶Oligo 序列设计：lentiCRISPRv2 使用 BsmBI 酶切。需要合成两条互补的单链DNA，确保其两端带有与载体匹配的粘性末端，便于后续连接：

1.Forward Oligo: 5' - CACC + G + 20bp Target - 3'

2.Reverse Oligo: 5' - AAAC + 20bp Target (Reverse Complement) + C - 3' (注意：如果 Fwd 加了 G，Rev 末端需补 C 配对)。

载体制备（酶切与纯化）

通过酶切打开载体骨架、去除冗余片段，同时防止载体自连，为sgRNA片段的插入创造精准位点。

1.酶切体系：

• 5 μg lentiCRISPRv2质粒

• 3 μL FastDigest BsmBI (Thermo)或BsmBI-v2(NEB)

• 3 μL FastAP(碱性磷酸酶，防止自连)

• Buffer补足至30-50μL

2.操作：37°C孵育30-60分钟。

3.胶回收：跑0.8%琼脂糖凝胶。

【切记】BsmBI切下的是一个约2kb的Filler片段，你需要回收的是大的载体骨架条带（约13kb），必须切胶回收以彻底去除stuffer，否则会有极高的背景假阳性。

Oligo退火与连接（Golden Gate 一步法）

先通过退火形成双链sgRNA，再通过连接反应将其与载体骨架拼接，形成完整的重组质粒。如果载体已经切好并回收，可以直接进行连接；如果是未切载体，也可以进行一步法反应。

1.Oligo 退火：将Fwd和Rev Oligo各稀释至100μM，让单链Oligo形成双链结构，使其末端粘性与载体匹配：

• 1μL Fwd Oligo

• 1μL Rev Oligo

• 1μL 10x T4 Ligase Buffer (含 ATP)

• 7μL水

【程序】PCR仪95°C5min，然后以0.1°C/sec 的速度降温至25°C。

2.连接反应：将双链 sgRNA 片段与酶切后的载体共价连接，构建重组质粒。

• 50-100ng BsmBI 酶切回收后的载体

• 1μL 稀释后的退火Oligo（1:200稀释）

• 1μL T4 DNA Ligase

• Buffer补足至10μL

【程序】室温（22-25°C）放置1小时，或16°C过夜。

转化与扩增（Stbl3的重要性）

让重组质粒进入大肠杆菌宿主，通过细菌增殖实现质粒的大量复制，获得足够量的完整质粒用于后续实验。

▶ 警示：慢病毒载体含有长末端重复序列（LTR），在大肠杆菌中极不稳定，容易发生同源重组导致质粒截短。

▶菌株：必须使用Stbl3、NEB Stable或SURE等重组缺陷型菌株。严禁使用DH5α！

▶培养温度：转化后的平板和液体摇菌，建议在30°C或32°C下培养，而不是标准的37°C。低温能显著降低重组发生率。

02 实验室里的魔鬼细节 —— 操作步骤与避坑指南

PCR：不仅是扩增，更是纠错

精准扩增目的片段的同时，最大程度避免碱基突变，保证片段序列完整性，为后续克隆提供高质量模板。

▶酶的选择：永远不要用Taq酶扩增克隆片段！Taq 酶错配率为1/2000，且末端会加腺嘌呤（A）。可使用高保真酶，其出错率比Taq低50-100倍，且产生平末端。

▶Tm值计算：不同聚合酶Buffer的盐离子浓度不同，Tm值也会改变。务必使用该品牌提供的在线Tm Calculator计算退火温度。NEB Q5酶通常推荐退火温度为Tm + 3°C。

酶切：星号活性的陷阱

特异性切割载体或目的片段，获得预设的末端结构，为后续连接反应创造条件，同时避免非特异性切割导致的片段紊乱。当你发现电泳图上一片弥散或出现了非预期的条带，很可能是发生了星号活性。

▶原因：限制性内切酶在非优化条件下（如甘油浓度>5%、酶过量、反应时间过长、低盐或有机溶剂存在）会丧失特异性，乱切DNA。

▶对策：

1.酶的体积永远不要超过反应总体积的10%（通常酶液含50%甘油）。

2.严格遵守推荐的孵育时间，不要随意“过夜”。

3.使用高保真版本的内切酶，它们经过工程改造，极大降低了星号活性。

连接：摩尔比的数学游戏

让载体与插入片段按最佳比例形成稳定的磷酸二酯键，减少空载体或多片段插入的无效连接，连接反应失败的常见原因是载体与插入片段比例失调。

▶黄金公式：插入片段质量(ng)=载体大小(kb)×摩尔比/载体质量(ng)×插入片段大小(kb)

▶推荐比例：载体：插入片段的摩尔比通常为1:3。对于平末端连接或大片段插入，可提高至1:5。

▶ATP陷阱：T4连接酶Buffer中含有ATP，反复冻融会导致ATP降解，这是连接效率突然下降的头号“嫌疑人”。

【建议】将Buffer分装成小管（10-20μL），每次使用一管，避免反复冻融。闻到Buffer有强烈硫醇味（DTT）是正常的，但如果出现白色沉淀，需温热溶解。

菌落PCR：假阳性的重灾区

快速筛选出含有重组质粒的阳性菌落，排除空载体或污染导致的假阳性，提高后续实验效率。当你挑了24个克隆，PCR全是阳性，但提质粒测序却全是空载体？可能遇到了“假阳性”。

▶原因：转化板上残留了未连接的插入片段 DNA，或者你挑菌时沾到了平板表面的 DNA。PCR 极其灵敏，把这些背景扩增出来了。

▶对策：

1.引物策略：不要用插入片段本身的引物！一定要用载体骨架上的通用引物（如CMV-F, BGH-R）进行扩增。这样，空载体扩增出小条带，阳性克隆扩增出大条带，一目了然。

2.挑菌技巧：挑取菌落后，先在新的LB板上划线备份，再将枪头放入PCR管；或者将菌落稀释在水中，取1μL水样做模板，避免带入过多杂质。

03 质量控制 —— 从测序到去内毒素

拿到阳性克隆只是开始，必须经过严格质控才能用于后续实验，确保质粒序列正确、无杂质污染，满足后续细胞转染或动物实验的要求。

Sanger测序：金标准

验证重组质粒的序列准确性，确保目的基因（sgRNA）无突变、读码框正确，避免因序列错误导致实验失败。

不要为了省钱只测两端。对于融合蛋白，必须进行通读测序，确保全长序列无突变，且读码框完全对齐，没有移码。对于CRISPR质粒，必须确认sgRNA的20bp序列没有丢失碱基（常见错误）。

质粒提取

获得高纯度、低内毒素的质粒，避免杂质或内毒素影响后续细胞转染效率和实验结果。

▶内毒素（Endotoxin/LPS）：大肠杆菌细胞壁成分。即使微量的内毒素也会显著降低原代细胞和干细胞的转染效率，并激活细胞的免疫反应，导致实验结果偏差。

▶必须步骤：对于细胞转染（尤其是难转染细胞）和动物实验，必须使用去内毒素Maxiprep试剂盒。普通Miniprep质粒仅限用于酶切鉴定和测序。

▶标准：转染级质粒的内毒素含量应<0.1EU/μg。

结语

质粒构建绝非“流水线式”的简单操作，而是“设计 - 策略 - 实战 - 质控”的完整逻辑闭环 —— 前期设计决定质粒的“先天潜力”，克隆策略选择影响构建效率，实操细节规避实验陷阱，质量控制保障最终可靠性。

从sgRNA的精准设计到内毒素的严格去除，每一个环节的细心把控，都将在后续实验中转化为清晰的结果与可靠的数据。

希望这份笔记能帮你避开隐蔽陷阱，让每一次克隆实验都能“一次成功”，为靶点筛选、基因编辑等研究筑牢根基。科研之路，细节为王，愿你在生物医学的探索中稳步前行，收获更多突破性成果~

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参考资料

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