#启动qiime2
source activate qiime2-2020.2
#创建工作目录并进入工作目录
wd=/mnt/d/Ju/
mkdir -p ${wd}
cd ${wd}
（一）自建库数据qiime2分析（V4区 515f/806r）
#测序原始数据更名
工作目录下建文件夹emp-paired-end-sequences
#将原始数据放入文件夹后重命名
Undetermined_S0_L001_I1_001.fastq.gz重命名为barcodes.fastq.gz
Undetermined_S0_L001_R1_001.fastq.gz重命名为forward.fastq.gz
Undetermined_S0_L001_R2_001.fastq.gz重命名为reverse.fastq.gz
mkdir -p emp-paired-end-sequences 将压缩的文件保存于创建的文件中
#数据导入：（数据建库类型为EMP双端序列）
EMPPairedEndSequences(数据来自EMP项目)
time qiime tools import --type EMPPairedEndSequences --input-path emp-paired-end-sequences --output-path emp-paired-end-sequences.qza
# 样本拆分：（按Barcode序列信息进行样品拆分）
time qiime demux emp-paired --m-barcodes-file Mapping_file_yellowhorn.txt --m-barcodes-column BarcodeSequence --p-rev-comp-mapping-barcodes --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza
#DADA2降噪：
time qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 250 --p-trunc-len-r 250 --o-table table.qza --o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0
#特征表可视化：
time qiime feature-table summarize --i-table table.qza --o-visualization table.qzv --m-sample-metadata-file Mapping_file.txt
#代表序列统计可视化：
time qiime feature-table tabulate-seqs --i-data rep-seqs.qza --o-visualization rep-seqs.qzv
#去噪过程统计可视化：
time qiime metadata tabulate --m-input-file denoising-stats.qza --o-visualization denoising-stats.qzv
#可视化结果：
table.qzv：特征表可视化。
rep-seqs.qzv：代表序列可视化。
denoising-stats.qzv：去噪过程统计数据可视化。
#特征表可视化：
time qiime feature-table summarize --i-table table.qza --o-visualization table.qzv --m-sample-metadata-file Mapping_file.txt
#代表序列统计可视化：
time qiime feature-table tabulate-seqs --i-data rep-seqs.qza --o-visualization rep-seqs.qzv
#去噪过程统计可视化：
time qiime metadata tabulate --m-input-file denoising-stats.qza --o-visualization denoising-stats.qzv
#可视化结果：
table.qzv：特征表可视化。
rep-seqs.qzv：代表序列可视化。
denoising-stats.qzv：去噪过程统计数据可视化。
#数据分类注释
time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
#生成物种可视化
time qiime metadata tabulate --m-input-file taxonomy.qza --o-visualization taxonomy.qzv
#过滤线粒体、叶绿体
time qiime taxa filter-table --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-exclude mitochondria,chloroplast --o-filtered-table table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza
#过滤不能分类
time qiime taxa filter-table --i-table table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-exclude Unassigned --o-filtered-table table-no-m-c-u.qza
#物种组成堆积图
time qiime taxa barplot --i-table table-no-m-c-u.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
#将过滤后的特征表转化为biom格式
qiime tools export --input-path table-no-m-c-u.qza --output-path exported-feature-table
#将taxonomy.qza文件导出为tsv格式
qiime tools export --input-path taxonomy.qza --output-path exported-feature_table
#将taxonomy.tsv添加到特征表
biom add-metadata -i feature-table.biom -o table.w_omd.biom --observation-metadata-fp taxonomy.tsv --observation-header OTUID,taxonomy --sc-separated taxonomy
#将特征表导出为txt格式
biom convert -i table.w_omd.biom -o table-no-m-c-u.txt --to-tsv --header-key taxonomy
# 构建进化树
time qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
#多样性分析
time qiime diversity core-metrics-phylogenetic --i-phylogeny rooted-tree.qza --i-table table-no-m-c-u.qza --p-sampling-depth 7000 --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
#Alpha多样性分析
#统计evenness组间差异是否显著
time qiime diversity alpha-group-significance --i-alpha-diversity core-metrics-result/evenness_vector.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization core-metrics-result/evenness-group-significance.qzv
#统计faith_pd组间差异是否显著
time qiime diversity alpha-group-significance --i-alpha-diversity core-metrics-result/faith_pd_vector.qza --m-metadata-file Mapping_file_Populustrichocarpa_3m_.txt --o-visualization core-metrics-result/faith_pd-group-significance.qzv
#统计observed_otus组间差异是否显著
time qiime diversity alpha-group-significance --i-alpha-diversity core-metrics-results_1/observed_otus_vector.qza --m-metadata-file Mapping_file-2.txt --o-visualization core-metrics-results_1/observed_otus-group-significance.qzv
#统计shannon组间差异是否显著
time qiime diversity alpha-group-significance --i-alpha-diversity core-metrics-results_1/shannon_vector.qza --m-metadata-file Mapping_file-2.txt --o-visualization core-metrics-results_1/shannon-group-significance.qzv
（二）公司测序拆包数据qiime2分析（V5-V7区 799f/1193r）
#数据导入（导入已拆分数据）
time qiime tools import --type SampleData[PairedEndSequencesWithQuality] --input-path data-manifest.tsv --output-path paired-demux.qza --input-format PairedEndFastqManifestPhred33V2
#去除引物
time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f AACMGGATTAGATACCCKG --p-front-r ACGTCATCCCCACCTTCC --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza --verbose &> primer_trimming.log
#可视化查看质量
time qiime demux summarize --i-data paired-end-demux.qza --o-visualization demux.qzv
#DADA2降噪（已拆分数据）：
time qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 210 --p-trunc-len-r 210 --o-table table.qza --o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0
#特征表可视化(已拆分数据)：
time qiime feature-table summarize --i-table table.qza --o-visualization table.qzv --m-sample-metadata-file Rhz-manifest.tsv
#代表序列统计可视化：
time qiime feature-table tabulate-seqs --i-data rep-seqs.qza --o-visualization rep-seqs.qzv
#去噪过程统计可视化：
time qiime metadata tabulate --m-input-file denoising-stats.qza --o-visualization denoising-stats.qzv
#分类注释器
#下载数据库
wget -c ftp://greengenes.microbio.me/greengenes_release/gg_13_5/gg_13_8_otus.tar.gz
#解压
tar -zxvf gg_13_8_otus.tar.gz
#导入参考序列
time qiime tools import --type 'FeatureData[Sequence]' --input-path gg_13_8_otus/rep_set/99_otus.fasta --output-path 99_otus.qza
#导入分类信息
time qiime tools import --type 'FeatureData[Taxonomy]' --input-format HeaderlessTSVTaxonomyFormat --input-path gg_13_8_otus/taxonomy/99_otu_taxonomy.txt --output-path ref-taxonomy.qza
#指定V5-V7区训练器
time qiime feature-classifier extract-reads --i-sequences 99_otus.qza --p-f-primer AACMGGATTAGATACCCKG --p-r-primer ACGTCATCCCCACCTTCC --o-reads ref-seqs.qza
#生产V5-V7区分类训练器
time qiime feature-classifier fit-classifier-naive-bayes --i-reference-reads ref-seqs.qza --i-reference-taxonomy ref-taxonomy.qza --o-classifier classifier_gg_13_8_99_V5-V7.qza
#数据分类注释（已拆分数据）
time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier classifier_gg_13_8_99_V5-V7.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
#数据分类注释
time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
#生成物种可视化
time qiime metadata tabulate --m-input-file taxonomy.qza --o-visualization taxonomy.qzv
#过滤线粒体、叶绿体
time qiime taxa filter-table --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-exclude mitochondria,chloroplast --o-filtered-table table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza
#过滤不能分类
time qiime taxa filter-table --i-table table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-exclude Unassigned --o-filtered-table table-no-m-c-u.qza
#物种组成堆积图
time qiime taxa barplot --i-table table-no-m-c-u.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
#将过滤后的特征表转化为biom格式
qiime tools export --input-path table-no-m-c-u.qza --output-path exported-feature-table
#将taxonomy.qza文件导出为tsv格式
qiime tools export --input-path taxonomy.qza --output-path exported-feature_table
#将taxonomy.tsv添加到特征表
biom add-metadata -i feature-table.biom -o table.w_omd.biom --observation-metadata-fp taxonomy.tsv --observation-header OTUID,taxonomy --sc-separated taxonomy
#将特征表导出为txt格式
biom convert -i table.w_omd.biom -o table-no-m-c-u.txt --to-tsv --header-key taxonomy
# 构建进化树
time qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
#多样性分析
time qiime diversity core-metrics-phylogenetic --i-phylogeny rooted-tree.qza --i-table table-no-m-c-u.qza --p-sampling-depth 7000 --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
#Alpha多样性分析
#统计evenness组间差异是否显著
time qiime diversity alpha-group-significance --i-alpha-diversity core-metrics-result/evenness_vector.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization core-metrics-result/evenness-group-significance.qzv
#统计faith_pd组间差异是否显著
time qiime diversity alpha-group-significance --i-alpha-diversity core-metrics-result/faith_pd_vector.qza --m-metadata-file Mapping_file_Populustrichocarpa_3m_.txt --o-visualization core-metrics-result/faith_pd-group-significance.qzv
#统计observed_otus组间差异是否显著
time qiime diversity alpha-group-significance --i-alpha-diversity core-metrics-results_1/observed_otus_vector.qza --m-metadata-file Mapping_file-2.txt --o-visualization core-metrics-results_1/observed_otus-group-significance.qzv
#统计shannon组间差异是否显著
time qiime diversity alpha-group-significance --i-alpha-diversity core-metrics-results_1/shannon_vector.qza --m-metadata-file Mapping_file-2.txt --o-visualization core-metrics-results_1/shannon-group-significance.qzv
