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图1|卡尔德斯蒙是收缩应力纤维的动态成分。一个具有代表性的3D-SIM图像显示，Caldesmon定位于可收缩的腹侧应力纤维和横向弧，但在U2OS细胞的非可收缩的背侧应力纤维中不存在。通过特异性抗体（上行）观察内源性卡尔德斯蒙，并应用mCherry-Caldesmon构建来确认该蛋白的亚细胞定位（第二行）。我们用荧光荧光素观察肌动蛋白丝。在底部的面板是在上面的面板中用白色的盒子表示的区域的放大倍数。其中，1、1‘和1“显示背侧应力纤维缺失内源性卡尔德斯蒙，2、2’和2”内源性卡尔德斯蒙定位位于腹侧应力纤维，3、3‘和3”卡尔德斯蒙定位位于横弧，4、4’和4”内源性卡尔德斯蒙定位位于皮质应力纤维。这些图像总结了至少三个人的观察结果
未经处理的野生型U2OS细胞（图b）的腹侧应力纤维，5µM对氨基泡比他汀处理的U2OS细胞（图c），以及野生型U2OS细胞腹侧应力纤维中GFP-NM-IIA重链的动态
e、恢复曲线表明，与NMII-A相比，卡尔德斯蒙是应力纤维的高度动态成分
f、GFP-卡尔德蒙在对照组和对氨基泡比他汀处理细胞中的恢复曲线提供了NM-IIA抑制不影响卡尔德蒙的动力学。图显示了三个实验中n = 21个（卡尔德斯蒙对照）、18个（卡尔德斯蒙泡比他汀）和23个（NM-IIA对照）细胞的平均±扫描电镜。

Caldesmon is an extended protein and its N-terminal domain associates with the neck of myosin II filament

两个不同蛋白质带了不同的标记，将看相互交联的情况，用了5个不同的区域，线的扫描看归一化荧光强度，NMIIA tail 和FL 的分布，看了几个不同点对应的情况

a、从表达全长卡尔德斯蒙的U2OS细胞中获得的3D-SIM图像的一个典型例子，其中mCherry（洋红色）和GFP（绿色）分别融合到蛋白的N端和c端。右边的面板是整个细胞图像中用白色盒子表示的区域的放大倍数。面板1‘中的黄线显示了一个用于线扫描的区域的示例。比例尺，整个细胞10µm，放大图像2µm
b、Cald-GFP的线形图分析表明，卡尔德蒙的N端和c端GFP与mCherry之间的平均距离为~0.3µm。线形图显示了来自三个细胞的n = 30细丝的归一化荧光强度±扫描电镜的平均值。
c、从表达mCherry-Caldesmon（洋红色）的U2OS细胞中获得的具有代表性的3D-SIM图像，并用NM-IIA尾巴特异性染色
d表达mCherry-Cald（洋红色）的U2OS细胞的代表性3D-SIM图像，并用NM-IIA RLC特异性抗体染色（绿色）。白色的盒子表示放大的区域。放大的图像1‘显示了一个用于线状图分析的NM-IIA线丝的例子。c和d面板，分别为5、2.5和1µm。
e、Caldesmonn端与NM-IIA尾共定位的线形图分析。线扫描=意味着来自三个细胞的n个= 15个细丝的±扫描电镜。
f、卡尔德斯蒙n端与NM-IIA RLC共定位。线扫描=意味着来自两个细胞的n个= 22个细丝的±扫描电镜。

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卡尔德斯蒙敲除细胞在细胞形态和迁移方面存在缺陷

a具有代表性的Western blot图像显示对照和卡尔德斯蒙寡聚1和寡聚2敲除（KO）U2OS克隆的全细胞裂解物中卡尔德斯蒙蛋白水平。选择由oligo1和oligo2 Cas9构建物产生的Caldesmon KO克隆2（第2和第6通道，绿色表示）进行进一步分析。以GAPDH作为加载对照。
b野生型和卡尔德斯蒙寡核苷酸2敲除U2OS细胞的代表性广域图像，在纤维连接蛋白涂层的弩形微模式上生长，并用文库林特异性抗体和大肝素染色。与野生型细胞相比，钙素耗尽的细胞显示出更少的应力纤维网络。比例尺，10µm。
c和d通过对野生型、寡聚1KO和寡聚2KO细胞以及表达GFP-Caldesmon的oligo1 KO和oligo2 KO拯救细胞进行高含量成像，分析细胞圆度（图c）和细胞大小（图d）
采用单因素方差分析进行比较，然后采用Tukey多重比较检验。p值经过了多重比较的调整。误差条表示0.05的显著性水平，CI为95%。p值： ****p = 0.0001。
e、通过野生型（n = 30）、寡聚1（n=37）、寡聚2（n=36）、寡聚1=（n=24）（n=34）U2OS细胞的高含量成像获得的随机迁移速度的图形表示。数据代表了四个实验的平均±标准差。
f、野生型、oligo2 KO和oligo2 KO拯救的U2OS细胞的代表性随机迁移轨迹显示了细胞的方向性。X轴和y轴上的值表示细胞从各自的平均位置迁移的程度。
g、伤口愈合试验的代表性例子，说明在0、12和24 h的时间点，野生型和oligo1 KO细胞覆盖的划痕区域。比例尺，400µm。
h、野生型、oligo1 KO和oligo2 KO U2OS细胞覆盖的伤口面积百分比（%）的图形分析。x轴表示计算伤口覆盖面积的%（y轴）的时间点h。这些值代表了三个独立实验的平均±标准差。源数据为pr

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这些结果确定了Caldesmon是确保非肌细胞肌动球蛋白束中规则的肌凝蛋白-ii间距的关键因素，并揭示了应力纤维网络是如何通过原肌凝蛋白-的动态交联来控制的

收缩肌动球蛋白束由薄的肌动蛋白丝和厚的肌凝蛋白II丝组成，是不同动物细胞类型和组织中关键的作用力生产者和机械传感器。它们包括横纹肌的肌原纤维、平滑肌的收缩细丝和非肌肉细胞的应力纤维1,2。肌原纤维由规则的、重复的产生力和负重装置组成，称为肌节，沿着肌动蛋白丝的主要沟槽，允许肌动蛋白-肌凝蛋白相互作用和肌肉收缩3。肌节内的两种结构，z盘和m带，将肌动蛋白和肌凝蛋白II丝固定在一个由巨大的蛋白肌动蛋白组成的弹性丝系统上。z盘包含了来自相邻肌节的α-肌动蛋白交联的反平行肌动蛋白丝和几个相关蛋白4,5。肌节中心的m带由六角形蛋白质组成，包括肌凝蛋白，它们将肌凝蛋白II丝定位在肌节的中间，因此在控制肌肉收缩时的力不平衡方面至关重要6。虽然横纹肌肌原纤维的结构了解相对较清楚，但对收缩肌动球蛋白的了解却知之甚少

肌滑肌和非肌细胞内肌动球蛋白束的组织是如何维持的，平滑肌和非肌细胞的力失衡是如何控制的一直是难以理解的。此外，应力纤维和平滑肌肌动球蛋白束不表达肌钙蛋白复合物，因此控制其收缩性的机制尚不完全清楚。平滑肌细胞和非肌肉细胞缺乏横纹肌肌原纤维的许多关键成分，如m带蛋白

卡尔德斯蒙的n端_{200残基区域与肌凝蛋白II和钙调素14相互作用，c端}200残基区域与肌动蛋白丝、原肌凝蛋白和钙调蛋白15-18结合。Caldesmon的c端区域在体外抑制了肌凝蛋白II的肌动蛋白激活的atp酶，钙调蛋白与该区域的结合降低了其对f-肌动蛋白的亲和力，释放了抑制作用

同时缺乏L-卡尔德斯蒙和H-卡尔德斯蒙的基因敲除小鼠在围产期死亡25，而H-卡尔德斯蒙的特异性缺失会导致动脉肌肉松弛缺陷26。在非肌肉细胞中，过表达卡尔德斯蒙会增加了肺癌A549细胞中应力纤维的厚度，而通过RNAi去除卡尔德斯蒙会导致应力纤维变薄27

过表达Caldesmon降低了SV80细胞的收缩性28。这些表型是由于肌动球蛋白束组织缺陷、肌动球蛋白束收缩性增加、肌凝蛋白II锁存状态的丧失，还是由于肌动球蛋白束的其他缺陷尚不清楚。卡尔德斯蒙表达水平的改变也与许多癌症的进展有关29、30和发育异常25、31-33，但其潜在机制尚不明确。

表明卡尔德蒙并不是肌凝蛋白II活性的负调控因子，而是交联肌凝蛋白丝和肌动球蛋白肌凝蛋白丝，以保持肌动凝蛋白束内肌凝蛋白II丝的规则间距

mCherry-卡尔德蒙沿收缩腹侧应力纤维和横向弧呈现周期性定位模式，但非收缩背侧应力纤维中没有

发现卡尔德斯蒙是一种高度动态的应力纤维成分，中场休息时间约为1-2s。如之前报道的7,38，NM-IIA重链的恢复比Caldesmon要慢得多

3D-SIM分析显示，Caldesmon的n端区域定位于肌凝蛋白II的颈部区域。这是因为mCherry信号显示了位于NM-IIA线圈-线圈信号两侧的两个峰（图2c和e），但位于单个NM-IIA束中的两个肌凝蛋白运动域信号峰之间（图2d和f）

总之，这些结果揭示了卡尔德斯蒙是细胞中的一个扩展分子。Caldesmon分别通过其n端区域和c端区域与肌凝蛋白II的颈部区域和tpm修饰的肌动蛋白丝结合

通过荧光肌动蛋白和弩微模式生长的长春蛋白特异性抗体的局灶粘附显示，敲除细胞中仍存在应力纤维，但与野生型U2OS细胞相比，应力纤维网络的组织不那么规律。敲除细胞的背侧应力纤维通常异常长，与细胞的前缘相比，横向弧线通常表现出“倾斜”的方向（图3b和补充图5a）

预计卡尔德斯蒙的消耗会导致应力纤维的收缩性的增加。为了研究卡尔德蒙在应力纤维收缩力中的作用，我们首先在野生型和卡尔德蒙敲除细胞上应用了牵引力显微镜（TFM）

被镀在8 kPa基质上时，野生型和敲除细胞均表现出相似的，主要的细胞质YAP定位。然而，在50 kPa基质上的细胞中，与Caldesmon敲除细胞相比，YAP在野生型细胞中显示出更深刻的核定位（图4e-g）

为了更详细地了解卡尔德斯蒙的消耗如何影响单个应力纤维的力学性能，我们对野生型和卡尔德斯蒙敲除细胞的横弧进行了激光纳米手术实验（图5a-f）

根据我们之前的研究45-48，我们通过RFP-Lifeact的慢病毒转导，观察了野生型和卡尔德斯蒙敲除细胞中的应力纤维。为了使细胞的形状和大小标准化，并诱导强烈的横弧形成，我们使用了弩形状的单细胞微图案玻璃覆盖物来模拟极化细胞的形状。然后，我们使用飞秒激光消融切断选定的横向弧，并将得到的与时间相关的缩回拟合到开尔文-Voigt（KV）模型中，以获得一个时间常数(τ)和平台缩回距离（Lo）。在某些情况下，弧收缩不符合KV收缩动力学，可能是因为弧的弯曲形态和KV模型假设的线性结构之间的断开。因此，我们对
所有SFs进行了第二次模型独立的分析，其中我们测量了消融60秒后切割纤维一端缩回的距离（图5b）在60 s时，我们没有观察到τ、Lo或收缩的两个细胞群之间的统计学意义上的显著差异，这意味着卡尔德斯蒙并没有显著影响单个横弧纤维的力学结构

在研究腹侧应力纤维的力学机制时，为了提高细胞形状和应力纤维长度的标准化，我们重新研究了矩形框架微模式的这些研究（补充图6a-e）。在这里，在框架的一个边缘引入了一个短的间隙，以促进腹侧的组装

由于卡尔德斯蒙的缺失导致了应力纤维网络的异常组织，我们接下来分析了卡尔德斯蒙的缺失对肌凝蛋白II束的分布和动力学的影响。重要的是，通过用抗NM-IIA重链抗体对细胞进行染色，我们发现在纤维连接蛋白覆盖的覆盖物以及弩微模式上，肌凝蛋白丝和丝堆积的异常分布（图6a；补充图7a）

在野生型细胞中，NM-IIA纤维沿着横弧和腹侧应力纤维均匀分布，但卡尔德斯蒙敲除细胞的前沿显示出NMIIA堆栈聚集在一起的区域，而其他的横弧区域完全没有NM-IIA。对图像的盲分析显示，~50%的敲除细胞沿着应力纤维显示出不规则的NM-IIA模式，而野生型细胞中相应的数量为<5%（图6b）

虽然NM-IIA纤维似乎在细胞边缘正常组装，但它们通常沿着横向弧表现出异常的横向运动，并进一步不平等地向相反的方向“拉”。这些事件导致NM-IIA纤维丝在某些应力纤维区域聚集，形成GFP-NM-IIA斑点团块，而其余应力纤维区域缺乏NM-IIA纤维丝（图6d；补充图11a、b；补充影片8-10）

为了分析不同Caldesmon结构域在调节NM-IIA分布中的作用，我们使用Caldesmon缺失结构进行了敲除-拯救实验（图8a）。对转染细胞上NM-IIA分布的盲法分析显示，全长mCherry-Caldesmon有效地挽救了敲除细胞中异常的肌凝蛋白分布。相比之下，缺乏n端（肌球蛋白结合）区域的∼并不能挽救表型，因为∼50%的细胞表现出不规则的NM-IIA分布（图8b）。请注意，这个值与从敲除细胞中定量的值相似（图6b）。缺乏卡尔德smon中心区域[Cald（1-200/374-531）]的结构在很大程度上挽救了肌凝蛋白表型，其中10%的_{细胞显示出不规则的NM-IIA分布。令人惊讶这个值与从敲除细胞中定量的值相似（图6b）。缺乏卡尔德smon中心区域[Cald（1-200/374-531）]的结构在很大程度上挽救了肌凝蛋白表型，其中10%的}细胞显示出不规则的NM-IIA分布

然而，许多表达这种结构的“拯救”细胞表现出另一种不寻常的肌凝蛋白表型，其中NM-IIA在很大程度上与应力纤维分离，并聚集在细胞的核周区域

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在野生型和卡尔德斯蒙敲除细胞中的应力纤维力学。在弩模式上表达U20S野生型和卡尔德斯蒙寡聚物2KO细胞的RFP-LifeAct的单横弧消融。上面一行是野生型，下面一行是卡尔德斯蒙KO。0s时的细胞表示消融前出现的SFs的分布，3s时的细胞表示消融后立即出现的SFs的分布。白色箭头表示在成像开始后的3、45和65 s，消融后应力纤维收缩的增加。比例尺= 10µm。bSF收缩测量和与模型无关的SF收缩计算示意图。c随时间跟踪的SF收缩的例子。缩回距离是t时刻被切断端之间的半距离。将SF的缩回与Kelvin-Voigt模型进行拟合，提取出平台的缩取出平台的缩回距离（L0）、粘弹性常数(τ)和在光烧蚀过程中被破坏的SF的长度（Da）（见“方法”部分）

野生型和Caldesmon KO U2OS细胞的独立SF收缩分析。WT和KO细胞应力纤维一端消融后t = 60 s的收缩分布。这些数据代表了来自三个实验重复的n=28（野生型）和n=28（卡尔德斯蒙KO）细胞的平均值± SD。差异不显著（双尾，非参数Mann-WhitneyU检验）。e野生型和Caldesmon KO U2OS细胞中切断的SFs的粘弹性时间常数(τ)和f平台收缩距离（Lo）。来自面板e和面板f的数据代表了来自三个实验重复的n=20（野生型）和n = 23（Caldesmon KO）细胞的平均值± SD。差异不显著（双尾，非参数Mann-WhitneyU检验）。非kv收缩被排除在(e)和(f)的数据集中。源数据作为源

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图6|卡尔德斯蒙保持了肌凝蛋白II沿应力纤维的规则分布。野生型和oligo2KO（虚线表示）U2OS细胞的典型例子，相互混合，用Caldesmon抗体，NM-IIA螺旋螺旋，用菌素染色观察f-肌动蛋白。右边的面板是左边面板中白色盒子所示区域的放大图，它们显示了野生型细胞中沿着f-肌动蛋白应力纤维（面板2）的NM-IIA（面板1）的规则模式。在Caldesmon敲除细胞中，NM-IIA丝和丝堆的分布不规则（图3），而肌动蛋白丝在没有NM-IIA的应力纤维区域也表现出均匀的分布（图4）。比例尺左图20µm，放大图像5µm。这些图像代表了四个实验。b盲分析野生型和Caldesmon KO细胞的百分比，显示NM-IIA细丝的规则、中间和不规则分布。卡尔德斯蒙耗尽干扰了NM-IIA细丝的正态分布。该数据代表了野生型（n = 193）和卡尔德斯蒙KO（n = 267）细胞从fp = 0.0433；**p = 0.0001；****p < 0.0001. c卡尔德斯蒙KO细胞的代表性图像（虚线表示），以及表达全长mCherry-卡尔德斯蒙的敲除拯救细胞。细胞用抗NM-IIA螺旋抗体和法菌素染色。放大图像（右）显示表达mCherry-Caldesmon的拯救细胞中NM-IIA丝分布规律（图1），而未转染的敲除细胞（图2）显示沿应力纤维的NM-IIA分布不规则。比例尺，15和5µm在整个细胞和放大图像。d表达RFP-actin和GFP-NM-IIA的野生型和卡尔德斯蒙KO细胞的代表性延时蔡司空气扫描图像。左侧虚线框所示区域的放大时间框架（右）显示野生型细胞中NM-IIA堆栈沿横向弧的规则向心流动而Caldesmon敲除细胞中出现NM-IIA丝的异常横向“滑动”。这导致NM-IIA在某些应力纤维区域中（用白色括号表示）积累，而其他应力纤维区域中大部分缺乏NM-IIA。比例尺，5和1µ

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卡尔德斯蒙消耗对α-肌动蛋白沿应力纤维定位的影响。一个表达GFP-α-肌动蛋白（绿色）和mCherry-卡尔德斯蒙（红色）的野生型U2OS细胞（上一行）的代表性SIM图像。白色的盒子表示放大的区域。放大图像1‘和2’中的细黄色的线代表了用于ofα-肌动蛋白/卡尔德斯蒙共定位的应力纤维区域的例子。下面一行显示了表达GFP-α-肌动蛋白（绿色）的卡尔德斯蒙KO细胞的代表性SIM图像，并用磷钙素对f-肌动蛋白染色（红色）。放大的区域1、2和3代表了α-的定位
野生型U2OS细胞中α-肌动蛋白共定位模式的线图分析。线扫描=平均来自3个细胞的n = 29丝的±扫描电镜。c-e对卡尔德蒙KO细胞中选定区域（1′、2′、3′的黄线）的代表性线扫描显示，在应激纤维内α-肌动蛋白丰富区域不规则分布。左、中、右面板的比例尺分别为5、3和1 μm

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图8卡尔德斯蒙及其不同结构域在保持肌凝蛋白II丝在轨道上的|功能。转染全长卡尔德蒙、1-20ryCald（1-200）、201-531）和（1-200-374-531）构建的卡尔德蒙寡核苷酸2KOU2OS细胞的典型例子。NM-IIA和F-actin分别通过抗NM-IIA螺旋抗体和菌素观察。虚线表示未转染的卡尔德斯蒙KO细胞，而转染卡尔德斯蒙的细胞可以通过mcherry表达来区分（第一行）。底部一行的放大图像，对应于上面的白色虚线框，突出了NM-IIA细丝在各自细胞中的分布。比例尺，15µm和5µm和放大图像。此外，右图显示了一个表达mCherry-Cald（1-200）的核周并通过其c端结构域与原肌凝蛋白-肌动蛋白丝结合，将肌凝蛋白II与原肌凝蛋白修饰的肌动蛋白丝连接起来。我们进一步提出，肌凝蛋白II运动结构域与Tpm4.2修饰的肌动蛋白丝相关(参考文献。而卡尔德斯mon更倾向于结合由其他非肌原肌凝蛋白亚型修饰的肌动蛋白丝。dd在野生型细胞（左）中，肌凝蛋白II丝在横向弧内显示有规则的间距。在没有Caldesmon（右）的情况下，肌凝蛋白II丝沿着肌动蛋白丝表现出异常的横向滑动，这导致了肌凝蛋白II丝在应力纤维中的不规则分布。因此，应力纤维网络的组织和力的平衡受到干扰，这进一步导致了细胞形态发生、迁移、侵袭和机械感应的缺陷。源数据作为源数据文件提供。