01.targetscan预测miRNA原理
TargetScan 基于序列互补原则，找到比对到靶 3'UTR 的保守性 8 mer、7 mer 或 6 mer 位点（seed match 序列），进一步根据热力学稳定性筛选得到 miRNA 的靶。seed 序列配对主要考虑三种类型：7 mer-1a(miRNA 的第 2-7nt 与靶基因互补配对, 而且 UTR 上与 miRNA 1nt 互补配对的位置是 A）；7 mer-m8 (miRNA 2-8nt 与靶基因完全配对)；8 mer (miRNA 2-8nt 与靶基因完 全配对,而且 UTR 上与miRNA 1nt 互补配对的位置是 A)。
由于很多通过保守的 seed match 序列找到的 target 不一定具有功能，而且有很多与靶基因配对的不具备保守性的 seed match 区域也找到了一些有功能的 miRNA 靶位点。targetscan 考虑到这点提出了seed match周围序列也会影响 miRNA 的靶功能，引入了 context score。主要包括如下几部分：
1. Site Type 8 mer > 7 mer-m8 > 7 mer-1a；
2. 3' pairing contribution：除了与 miRNA seed 区域配对，与 miRNA12-16nt 的配对也有可能对 miRNA target 的功能产生影响；
3. local AU contribution：AU rich 的区域更有可能有功能；
4. position contribution：miRNA 靶位点至少离终止密码子15nt，且功能性 site 更可能位于 UTR 两端而不是中间，中间往往存在复杂二级结构不利于靶位点结合。
考虑这些因素后，对于不具备保守性的 seed match 区域也可以计算相应的 context score。将保守和不保守区域的 context score 进行排序即得到 context score percentile。一般考虑 context score percentile > 90 为预测的可能具有功能的 miRNA 的靶。
02.Targetscan 预测所需文件准备
miRNA_family文件可以在targetscan官网下载：miRNA_family_info.txt
step 1、首先需要准备两个文件：miRNA 的 fa 序列以及 target 的 fa 序列文件。
step 2、将上述文件转换为 targetscan 预测需要的格式。
其中 miRNA 的序列文件转换为如下格式（任意一种均可）：
格式 1：包含四列，分别是：miRNA 家族、物种 ID、miRBase 的 ID、成熟的 miRNA 的序列。
格式 2：包含三列，分别是：miRBase 的 ID、成熟的 miRNA 的第一到第七位的序列、物种 ID。
target 的 fa 序列转换为如下格式，即包含三列：ID、物种 ID、序列。
Usage:
perl ../targetscan_70.pl miR_9606_info.txt query.fa target_Results.txt
03.Targetscan 结果文件解读
其中标题各列的含义如下：
GeneID ：name/ID of gene (from UTR input file) #Query gene的ID
miRNA_family_ID：name/ID of miRNA family (from miRNA input
file) #预测到的靶miRNA的ID
species_ID ：name/ID of species (from UTR input file) #物种的ID
MSA_start ： starting position of site in aligned UTR (counting gaps) #比对到Query的起始位置（包括gaps）
MSA_end：ending position of site in aligned UTR (counting gaps) #比对到Query的终止位置（包括gaps）
UTR_start ： starting position of site in UTR (not counting gaps) #比对到Query的起始位置（不包括gaps）
UTR_end： ending position of site in UTR (not counting gaps) #比对到Query的终止位置（不包括gaps）
Group_ID ：ID (number) of site(s) (same gene, same miRNA) that overlap #相同基因、miRNA的靶位点的overlap的组
Site_type ： type of site in this species (m8 [7mer-m8], 1a [7mer-1A], or m8:1a [8mer]) #比对的类型
miRNA in this species ：if "x", then this miRNA has been annotated in this species #如果为“x”则表示此miRNA被注释到这个物种
Group_type ： type of this group of sites; if 'Site_type' in a 'Group_ID' is heterogeneous, "weakest" type of the group is used #如果query gene是heterogeneous，则使用最弱的模式
Species_in_this_group ：list of species names/IDs in which this site is found #在这个group中的物种ID列表
Species_in_this_group_with_this_site_type ：for hetergeneous groups only #仅对为hetergeneous 组
ORF_overlap ： If site in the UTR sequence is lowercase (indicating ORF overlap), this will be set to 1. Typical UTR sites have a value of 0. #如果Query 序列是小写的（表示ORF重叠）将被设置为1；典型的位点设置为0。
参考资料：
1.Conserved Seed Pairing, Often Flanked by Adenosines, Indicates that Thousands of Human Genes are MicroRNA Targets
2.R批量预测miRNA和靶基因之间的调控关系-TargetScan篇
