Complement activation assays
complement system
Protocol
- 96孔酶标板使用以下物质包被4℃过夜：
- Classical pathway: 含2.5gµ/ml人免疫球蛋白（IgG）的Carbonate Buffer
- Alternative pathway: 含20µg/ml酵母多糖（zymosan）的Carbonate Buffer
- Lectin pathway: 含100µg/ml 甘露醣（mannan）的Carbonate Buffer
- 每个孔用200µl的blocking solution室温下封闭2h。
- 96孔酶标板使用以下物质孵育：
- Classical pathway: 含3%人类血清的DGVB2+ Buffer室温下孵育20min（检测C4b和C3b）
- Lectin pathway: 含3%人类血清的DGVB2+ Buffer室温下孵育45min（检测C1q和C9）
- Alternative pathway: 含5%人类血清的Mg2+EGTA buffer室温下孵育35min（检测C3b）或者37℃孵育1h（检测C9）
- 使用适用于ELISA的C4b、C3b、C1q、C9室温下孵育1h。
- 使用含HRP的相应二抗室温下孵育30min。
- 使用1,2-phenylenediamine dihydrochloride检测490 nm处测定吸光度。
材料
wash buffer:
50 mM Tris-HCl (pH 8.0)
150 mM NaCl
0.1% (v/v) Tween 20Carbonate Buffer:
75 mM sodium carbonateblocking solution:
1% (w/v) BSA in PBSDGVB2+ Buffer:
2.5 mM Veronal buffer (pH 7.3)
70 mM NaCl
140 mM glucose
0.1% gelatin
1 mM MgCl2
0.15 mM CaCl2人类血清
Mg2+EGTA buffer:
2.5 mM Veronal buffer (pH 7.3)
70 mM NaCl
140 mM glucose
0.1% gelatin
7 mM MgCl2
10 mM EGTA
