Identification of a Novel Prognostic Gene Signature From the Immune Cell Infiltration Landscape of Osteosarcoma

从骨肉瘤的免疫细胞浸润情况中鉴定新的预后基因特征

发表期刊：Front Cell Dev Biol

发表日期：2021 06 September

DOI:10.3389/fcell.2021.718624

期刊相关信息

一、背景

        近年来，肿瘤微环境（TME）在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用，受到了人们的关注。肿瘤微环境包括肿瘤细胞、成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞、各种信号分子和细胞外基质。最新研究表明，肿瘤免疫细胞浸润（ICI）与骨肉瘤（OS）患者的临床结果有关。骨肉瘤的TME由骨细胞、基质细胞、血管细胞和免疫细胞组成。对TME的广泛研究表明，浸润性免疫细胞在肿瘤扩散、复发、转移和免疫治疗反应中起着至关重要的作用。然而，浸润OS的免疫细胞的详细情况尚未阐明。以前的研究主要集中在一两种免疫细胞或关键基因上，这可能会影响OS微环境的探究。从肿瘤浸润性免疫细胞图谱中识别多个基因有助于构建具有预后潜力更好且更准确的基因特征。为了填补这一空白并找到针对OS预后的潜在诊断方法，本研究基于ICI内容对患者进行聚类，以确定预后基因特征。

二、材料与方法

1.数据来源

训练队列：TARGET数据库中获取TARGET-OS（n=88）

验证队列：GEO数据库获取的GSE21257数据集（n=53）

2.实验流程

图1    流程图

三、实验结果

1.TICs的一致性聚类

        作者采用了CIBERSORT和ESTIMATE算法。得到了所有OS样本的ICI分布。从“ConsesusClusterPlus”R包生成的聚类结果中发现了两个独立的ICI亚型（图2A）。更重要的是，在随后的Kaplan–Meier分析中发现这两个亚群之间存在显著的生存差异（图2B）。总之，ICI簇A与良好的预后相关，而ICI簇B的总生存期较短。

图2 肿瘤浸润免疫细胞的一致性聚类

2.预后基因特征识别

        使用“limma”R包进行了差异分析，以确定两个ICI簇之间的转录组水平的差异从而揭示不同免疫表型的潜在生物学特征，共发现4501个DEGs。在随后的分析中，建立了Kaplan–Meier分析和单变量Cox比例风险模型用来测试DEGs的预后能力。在这两项试验中，仅将p值<0.05的DEGs作为潜在的预后基因，最终有15个基因被确定为潜在的预后基因。 然后将它们放入一个基于总体生存率的Cox模型，并进行Lasso回归分析（图3A），以进一步缩小和选择。Lasso算法输出结果表明：当模型有九个基因时，它可以达到最佳性能（图3B），每个基因的回归系数由“glmnet”R包生成(表2)。

图3    构建预后基因特征的Lasso回归分析

表2

3.九个基因特征的验证

        根据风险评分中位数将OS患者分为高风险组和低风险组。图4展示了OS队列中特征的整体视图，包括风险评分分布、生存状态/时间分布图和基因表达热图。如图4和图S2所示，在训练队列和验证队列中，ANXA5、ZFP90、ATP6V1E1、SELPLG、PLD3和IFNGR1与OS患者的良好预后相关，而DLEU2、UHRF2和PLCB4与不良预后相关。

图4    训练中九个基因特征的风险评分（上）、生存状态（中）和基因表达谱（下）的总体分布

图S2    在训练 (A) 和验证 (B) 队列中使用 Kaplan-Meier 测试的九基因特征中每个基因的预后预测能力

        在 TARGET-OS 队列和 GSE21257 队列中构建的 Kaplan-Meier 分析证明了高风险组和低风险组之间显著的生存差异。以上分析都证明了高风险组的生存可能性要低于低风险组（图5）。

图5    在训练队列中评估九个基因特征的预测能力

        作者利用训练和验证队列的可用临床协变量（协变量包含：风险评分、性别、年龄、种族、民族、转移状态、肿瘤部位和组织学亚型）构建了单变量和多变量Cox比例风险模型，以验证九个基因特征的预后和独立性能力（图6）。在训练队列中建立的Cox模型表明，在单变量和多变量分析中，风险评分是唯一的显著影响OS预后的因素。与训练队列一致，验证队列中Cox模型也证实了基因特征的强大预测能力。在该分析中，转移因子也被证实具有预后能力，但在其p值低于风险评分。基于上述证据，可以合理地推断出这九个基因特征具有很强的独立预后能力。

图6    建立了单变量和多变量Cox比例风险模型，以测试训练和验证队列中九个基因特征的预测能力

        ROC曲线下的面积称为AUC，目前被认为是评估预测分布模型准确性的标准方法。IAUC是一种有效的工具，可以根据个体在特定时间点的真实疾病状态来评估候选标记物的性能。IBS是模型预测的总体指标。作者在这一步使用ROC曲线、IAUC和IBS来验证九个基因特征的预测能力，并将其与其他变量进行比较。如图7A所示，对于在训练队列中进行的分析，在1年、3年和5年时，基因特征的AUC分别为0.874、0.830和0.883，IAUC结果显示，与所有时间点的所有其他因素相比，风险评分保持在更高的水平。此外，IBS在整个过程中保持在最低水平。在1年、3年和5年的时间点，GSE21257（图7B）的风险评分AUC=0.724，并且在任何时候都大于其他变量。在任何时间该特征的IBS也低于其他临床特征。以上结果表明，作者发现的基因特征优于其他临床因素。

图7    进行ROC曲线、综合AUC分析和综合Brier评分分析以检验九个基因特征在训练中的预测能力

4.九种基因特征与之前的模型的比较

        作者选择了9项研究作为对比。Kaplan–Meier曲线是根据作者的九个基因特征以及训练和验证队列中的候选特征绘制的（图8）。Kaplan–Meier图表明，在TARGET-OS和GSE21257队列中，只有9个基因的特征和Yang研究中的特征可以预测预后。但是作者的9个基因特征的p值比Yang等人的p值更具有说服力。此外，在训练和验证队列中使用这些基因特征建立了单变量Cox模型（图9）。单变量Cox回归结果显示在这些队列中，只有作者的9个基因特征具有预后能力。从上面提到的证据来看，九个基因特征优于之前研究的基因特征。

图8    使用Kaplan-Meier分析对九种基因特征和以前在训练和验证队列中进行的研究进行比较

图9    使用单变量Cox-Zards模型，将九个基因特征与之前在训练和验证队列中进行的研究进行比较

5.利用GSEA对基因特征进行功能注释

        为了理解该特征潜在的分子机制，作者对TARGET-OS队列中的高风险组和低风险组进行了GSEA比较。在低风险组中均检测到丰富的基因集，主要参与与移植排斥反应、凝血系统、IL-6/JAK/STAT3信号轴、药物代谢、炎症反应、干扰素反应、顶端连接复合体、上皮细胞顶端表面和先天免疫系统相关的机制。注释分析表明，两组之间的差异与免疫有关，因此作者对22个TIC进行了分析，以进一步研究基因特征与免疫微环境之间的相互作用。

        首先，采用CIBERSORT算法绘制22个TIC分布情况，为下一步分析做准备。Wilcoxon秩和检验（图10A）发现了五种与基因特征相关的TICs，斯皮尔曼系数（图10B）发现了八种与风险评分相关的TICs。然后构建维恩图来可视化这些结果，并发现有五个TIC（图10C）展现出与基因特征风险评分有显著关联，分别是CD4 naïve T细胞、CD8 T细胞、活化肥大细胞、单核细胞和调节性T细胞。具体来说，风险评分与CD4 T细胞和活化的肥大细胞呈正相关，与其余的细胞呈负相关。

图10    整合分析以确定22个TIC和9个基因特征之间的关系

        作者通过Kaplan-Meier和Cox比例风险模型进一步测试了22例TIC的预后能力。Cox模型指出，激活的肥大细胞不仅在单变量中影响OS结果，而且在多变量Cox回归中也影响OS结果（图11A）。除此之外，Kaplan-Meier分析表明活化的肥大细胞、CD4 T细胞和CD8 naïve T细胞能够预测OS的预后（图11B）。活化的肥大细胞在OS中具有潜在的预后能力。

图11    评估 22 个 TIC 的预后能力

       这一步显示的所有分析结果显示，活化的肥大细胞不仅与基因特征显著相关，而且还预测OS预后。因此，活化的肥大细胞大量浸润可能在OS患者的九种基因特征的预后能力中发挥关键作用。

四、结论

        本研究从OS患者的ICI特征定义了一个新的九个基因特征，该特征与OS预后密切相关，可以敏锐地确定OS患者的风险评分。 此外，作者通过将其应用于一个独立的验证队列来证明该特征的稳定性和广泛适用性，并证明其优于之前研究中的特征。 研究还确定了激活的肥大细胞在改特征的预后能力中的重要作用，可能会促进OS治疗方法的发掘。