NGS仪器带来了两个重大变化：
- 读长变得非常短（50-300bp）
- 读段非常多（亿数量级）
NGS序列比对的方式：
将测序读段与已知基因组（也叫re-sequencing）或彼此之间（称为assembly）进行比对。由此开发出“短读比对工具”或“短读映射工具”。
由于illumina公司在NGS领域的统治地位，多数短读比对工具是为illumina测序仪产生的50-300bp的短读段设计的，用于对数以亿计的短读段进行比对。
短读比对工具（short read aligner）的工作原理
一个经过优化的短读比对工具每秒可以将1万条短读序列同人类基因组的30亿碱基序列进行比对，但不同短读比对工具的比对结果却有很大的不同，且很难对结果之间的差异进行理解、描述和分类。
具有代表性的短读比对工具需要能够发现：
- exact matches
- missing locations
-
partial and alternative matches/overlaps
但往往一个工具在上述某一方面的良好表现牺牲了该工具在上述其它方面的表现。
因此，工具的表现是否优异关键取决于它们擅长分析的数据类型，而特定数据类型往往又集中于特定区域(domain)。 要针对不同的区域选用不同的比对方法。
短读比对工具的局限性
- 大多数短读比对工具只能找到与target颇为相似的alignments。The algorithm will generally “gives up” searching beyond a certain threshold. (???)
- 短读比对工具旨在找到高度相似的区域。
- 大多数短读比对工具无法处理长读或处理时非常低效。
- 读段的长度也不能太短
短读比对工具所能比对的最小读长是和算法及运用相关的，许多工具无法处理读长30bp以下的片段。在研究smallRNA时，如microRNA，则需要选择可以比对短读段的工具，但选择非常有限。
读段映射（read mapping）的概念
The word “mapper” is often used to emphasize that the optimal alignment of a read is not guaranteed. (???) 映射工具的目的是定位基因组中的一个区域，而非产生和那个区域最佳的比对。
映射
映射是找到放置读段的区域。
如果映射位置与真实区域重叠，则认为映射正确。
比对
比对是每个碱基在读段中的确切摆放。
如果每个碱基位置正确，则认为比对是正确的
我们可以举出一些比对正确但映射不正确的例子，也可以举出一些映射正确而比对不正确的例子。
理论上比对和映射应该是一致的，但实际情况可能不是这样。
比对工具和映射工具的区别
映射和比对之间的区别是确实存在的，尽管目前的工具综合了比对和映射的方法，但针对不同研究，工具的选择仍应当有所偏向。
如：研究基因组中SNP和变异主要依靠比对。研究ChIP-Seq数据主要依靠映射。
如何选择最好的短读比对工具
可以从bwa和bowtie2这些在各个领域综合表现良好的工具入手。
可以通过对各个工具实际表现的评估、阅读文献、咨询同行，挑选出最适合目前分析的数据的工具。
工具的选择也存在“信仰加成”。比如Broad Instituted的科学家爱用bwa，华大基因的科学家爱用novoalign，因为是他们自己开发的。
当我们在挑选短读比对工具时，我们在挑选什么？
在选择工具时，要考虑：
比对算法：全局，局部或半全局？
比对工具可以根据外部参数过滤alignments吗？
比对工具能否为每个query报告多个alignment？
比对工具将如何处理INDELs（插入/删除）？
比对工具可以跳过（或拼接）内含子区域吗？
比对工具可以找到嵌合比对（chimeric alignments）吗？
chimeric alignment:“嵌合比对” 的形成是由于一条测序read比对到基因组上时分别比对到两个不同的区域，而这两个区域基本没有overlap。因此它在sam文件中需要占用多行记录显示。只有第一个记录被称作"representative",其他的都是"supplementary"【Chimeric reads are also called split reads】
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