上期推出了第一期m6A修饰的相关问题汇总，解答了有关m6A修饰的一些入门级问题，本期继续推出相关问题汇总，深入探讨m6A机制研究的难点与挑战。m6A的研究故事怎么讲？之前的研究思路在自己所关注的疾病过程中是否适用？一直在讨论稳定性、翻译效率、降解等关键词，但m6A这些作用是普适性的功能还是具有时空特异性？随着研究成果的不断积累和相关讨论的不断深入，是时候系统性的总结归纳现有研究对我们的启发与思考了。在第二期问题汇总中，一起来看看有哪些有关机制讨论的相关问题被研究者关注，文中相关观点和文献支持结合2021年发表的文献综述进行讨论，感兴趣的老师可以后台回复“文献”进行索取。
参考文章封面：
有关m6A修饰的序列偏好性、区域偏好性、位置选择、METTL3/METTL14、m6A发生的内外调控系统、时空特异性问题请见上一期文章。本期将重点围绕Reader蛋白和Eraser蛋白讨论研究者经常关心的其他问题：
一.蛋白可以识别并结合m6A位点，这种结合有什么特征？对结合的RNA稳定性有什么影响？
在综述文章中，作者描述依赖于m6A降解和翻译的过程是“context-dependent”，这里的context指的是被m6A修饰mRNA分子具体的相关特征，也就是结合带来的影响要看修饰位点的位置、区域、Reader蛋白的类型，以及最重要的被修饰RNA分子的特征。
目前多个相关研究中达成共识的是m6A可以通过YTHDF2分子结合降低mRNA稳定性，与之相反的是IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3识别m6A位点增强mRNA稳定性（图1）。RIP-seq可以看到YTHDF2蛋白的结合位点信息与m6A的位点分布近似，但是IGF2BP1-3分子的结合位点的分布则与这两者不同。不同之处在于IGFBP1-3结合位点没有富集于终止密码子，而是均衡分布于3’UTR区，IGF2BP1-3和YTHDF2的结合位点重合度也比较低。尽管IGF2BP1-3与m6A RNA结合的模式还没有完全解析，但是可以推测他们是通过KH功能域同m6A RNA结合。因此，被m6A修饰的RNA片段是和IGF2BP1-3结合变得更加稳定，还是和YTHDF2结合变得不稳定，主要还是看m6A RNA片段的周围序列特征和相应结合的蛋白活性。
(Recognition of RNA N6-methyladenosine by IGF2BP proteins enhances mRNA stability and translation)
二.Reader蛋白对结合的RNA翻译过程有什么影响？
m6A影响mRNA翻译也是有类似的特征，相关研究显示在HeLa细胞和子宫内膜癌细胞中，YTHDF1选择性的结合到m6A修饰转录本并增强翻译效率，但是这种YTHDF1对翻译的上调作用是否明显主要还是看具体的细胞环境，在HEK293T细胞系和乳腺癌细胞系中人工构建的m6A报告基因的上调效果就并不明显。最近围绕学习和记忆缺陷的小鼠模型的研究中发现，这种情况下YTHDF1介导的翻译上调作用有可能由外界的刺激因素而诱导引发，海马特异的敲除YTHDF1可以引起小鼠的空间记忆缺陷和情景恐惧记忆（contextual fear memory）。在培养的海马神经元的稳态环境中，YTHDF1对翻译的影响相对温和，但是在使用氯化钾去极化处理后，这种影响会变得更加明显，同时在围绕背根神经节（dorsal root ganglion）的研究发现，虽然正常情况下YTHDF1对背根神经节的影响比较微小，但是在损伤诱导轴突再生过程中，YTHDF1促进蛋白合成是必不可少的环节。
(m6A facilitates hippocampus-dependent learning and memory through YTHDF1)
m6A修饰的具体位置也会改变YTHDF1对于翻译的影响，5’UTR m6A能够增强非帽结构依赖的翻译起始，在CDS区域的m6A位点可以调控翻译延伸，终止密码子附近和3’UTR的m6A位点可以被YTHDF1和YTHDF3识别，增强翻译起始，总而言之，不同的位置修饰位点，对RNA带来的影响也会有所区别。
三.除了mRNA本身以外，m6A对非编码的影响如何？又是怎样发挥功能的？
除了mRNA发生m6A修饰以外，非编码RNA同样广泛存在m6A修饰是被广泛认同的事实，只是之前大部分研究聚焦在mRNA m6A。在另外一类非编码RNA分子中（综述文章称为非编码染色体相关调控RNA，non-coding chromosome-associated regulatory RNA，carRNA）m6A修饰同样重要，m6A本身可以造成这些carRNA的降解从而影响这些非编码RNA分子的临近基因。举个例子，在自我更新和分化的ESCs中，早期的研究关注的是细胞质m6A阅读蛋白对整个细胞表型的影响，细胞质中，编码多能性维持因子蛋白的转录本容易发生m6A修饰进而被YTHDF2结合促进其降解，细胞也在特定时间点从胚胎干细胞开始分化，Mettl3敲除导致早期胚胎致死，Ythdf2敲除鼠可以维持到胚胎发育晚期，所起作用类似于在核中敲除Ythdc1（核m6A Reader蛋白），说明m6A可能在细胞核中也发挥重要作用。
(m6A RNA methylation: from mechanisms to therapeutic potential)
高通量测序的结果表明，METTL3不仅可以催化带有polyA结果的mRNA和lincRNA发生m6A修饰，同时，对非polyA结构的线性转录本、启动子相关转录本（promoter-associated RNA）、增强子RNA（enhancer RNA）、转座元件来源RNA（repeats RNA）也发生m6A修饰，这些非编码RNA分子被统称为carRNA，其中15%-30%均含有m6A修饰，METTL3敲除可以广泛的上调这些RNA丰度。METTL3的敲除可以增强染色质的开放性，广泛的上调转录活性（图3），由于paRNA和eRNA是部份基因转录的上游调控因子，因此这些m6A修饰的paRNA或者eRNA在METTL3敲除后均能上调靶分子，m6A水平下降可以延长carRNAs的半衰期，最终上调下游基因的转录，提高局部H3K4me3和H3K27ac的水平，表明m6A修饰carRNA可以间接实现调控转录的过程。
四.去甲基化的调控过程是怎样的？
m6A过程动态可逆的特点是非常重要的，ALKBH5和FTO是两个目前认为最重要的去甲基化酶，在癌症进展、免疫和精子形成过程中都发挥重要作用。FTO的特点是功能非常强大，强大到在很多病理、生理过程中都能发挥作用，对于分子来讲，从pre-mRNA、可变剪切、多聚APA到翻译，FTO每时每刻都在发挥作用；FTO的底物非常广泛，以至于m6A、m6Am、tRNA m1A都能被FTO调控发生去甲基化，有关于FTO活性和底物的争论还有很多。研究表明，对于FTO的底物选择更多的依赖于FTO的亚细胞定位，对m6A去甲基化作用更多的是在细胞核中被报道，对m6Am的去甲基化作用更多的研究是围绕细胞质进行。由于FTO的作用十分强大，且底物分布十分广泛，在AML细胞甚至FTO介导了40% mRNA m6A的去甲基化过程，有关FTO作用主导的调控细节仍有不少争论点，下面的例子说明，想要研究清楚FTO到底通过哪条途径影响表型并不是一件容易的事。
(Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm)
由于FTO的影响涉及多种底物，因此对特定过程中FTO对其生物功能影响是比较复杂的，例如FTO的敲除大部分情况会引起小鼠模型的胚胎致死，即便是幸存的模型鼠发育明显缺陷，体重较对照更轻，那这种表型变化到底是由于FTO使哪种底物的m6A修饰发生了去甲基化作用而产生？
分别做实验来看，首先敲除介导mRNA帽子结构和U2 snRNA m6Am修饰的Pcif1或者Mettl4酶，表型不明显，也不影响小鼠的生存情况，但是敲除Mettl13、Mettl14（催化mRNA m6A）就会明显引起胚胎致死，需要注意的是，相比于Fto敲除，Mettl14\Mettl3 敲除鼠表现出更严重的发育问题，而Fto敲除鼠的发育问题相比Pcif1或者Mettl4敲除鼠更严重，因此cap mRNA、U2 snRNA m6Am甲基化对于胚胎发育过程并没有那么广泛。这些比较实验说明，mRNA 和U2 snRNA m6Am修饰的去甲基化并不是造成Fto 敲除导致发育缺陷表型的主要原因。
五.Open Question：当前m6A研究的难点和挑战在哪里？
m6A对mRNA的功能影响是多变且多面的，举两个例子来看：在Hela细胞中，YTHDF蛋白均促进RNA降解，结合位点、蛋白相互结合以及亚细胞定位pattern均呈现相似的结果，研究结果甚至表明YTDHF1在Hela细胞中并不能促进翻译；第二项研究中，Lasman等人发现在小鼠的早期发育过程中，mESCs中三个阅读蛋白之间存在代偿关系，相比于同时敲除三个蛋白，单独敲除某一个Ythdf蛋白不会造成mESC分化和mRNA的降解。由此看出，针对包括Writer、Reader、Eraser在内的各项研究都具有自己的特点和特性，并不能以一盖全，整个调控过程极其复杂，甲基化去甲基化的动态过程受多方面调控，因此针对特定的生物学过程的相关表型，结合之前的类似研究，进行综合性的评价和讨论，才能完善m6A的调控机制和作用关系。
(YTHDF3 facilitates translation and decay of N6-methyladenosine-modified RNA)
第二期的总结当中，讨论了一些有关m6A RNA的重要机制问题，整体来看RNA m6A的功能多样，分布广泛，在不同的生物学过程中既有共性也有特性，下一期的RNA m6A问题总结中，我们将整理一些有关m6A分析的常用生信工具和技术手段，方便各位研究者查询有效信息，辅助m6A相关研究，敬请期待！
