1.Module 1 - Introduction to RNA sequencing
- Installation
- Reference Genomes
- Annotations
- Indexing
- RNA-seq Data
- Pre-Alignment QC
2.Module 2 - RNA-seq Alignment and Visualization
- Adapter Trim
- Alignment
- IGV
- Alignment Visualization
- Alignment QC
3.Module 3 - Expression and Differential Expression
- Expression
- Differential Expression
- DE Visualization
- Kallisto for Reference-Free Abundance Estimation
4.Module 4 - Isoform Discovery and Alternative Expression
- Reference Guided Transcript Assembly
- de novo Transcript Assembly
- Transcript Assembly Merge
- Differential Splicing
- Splicing Visualization
5.Module 5 - De novo transcript reconstruction
- De novo RNA-Seq Assembly and Analysis Using Trinity
6.Module 6 - Functional Annotation of Transcripts
- Functional Annotation of Assembled Transcripts Using Trinotate
4.1 Reference Guided Transcript Assembly
利用Stringle和Ballgown发现从头组装的转录本和差异表达
在上一个模块中，使用Stringtie的'-G'和'-e' 选项在'reference only'模式下运行Stringtie。
在本模块中，我们将以另外两种模式运行Stringtie:“reference guided”模式及(2)“de novo”模式。在已知转录本的帮助下，Stringtie可以预测每个文库中存在的转录本。然后，Stringtie将为每个由数据组装的转录本分配任意的转录本id，并估计这些转录本的表达。这种方法的一个复杂之处在于，在每个库中，都可能预测出一组不同的转录本。可能有很多相似之处，但是在每个库的输出文件中，转录的数量和它们的确切结构是不同的。因此，在跨库进行比较之前，需要确定哪些转录本在跨库之间相互对应。Stringtie提供了一个merge命令来组合来自不同库的预测文本GTF文件。
一旦有了一个合并的GTF文件，就可以用它来运行Stringtie，而不是我们以前使用的已知的transcripts GTF文件。合并的GTF被用来重新计算表达估计在准备运行Ballgown使用合并新转录本。
To run Stringtie in 'reference guided' mode: use the '-G' option WITHOUT '-e'
To run Stringtie in 'de novo' mode do NOT specify either of the '-G' OR '-e' options.
参考Stringtie手册获得更详细的说明:https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml?t=manual
Running Stringtie in Reference Guided Mode
使用我们在前面模块中生成的对齐，现在只使用'-G'选项在reference guided模式下运行Stringtie。
额外选项如下
- '-p 8' tells Stringtie to use eight CPUs
- '-G ' reference annotation to use for guiding the assembly process (GTF/GFF3)
- '-l' name prefix for output transcripts (default: STRG)
- '-o' output path/file name for the assembled transcripts GTF (default: stdout)
首先，创建一个输出目录，然后以reference guided模式运行stringtie。
mkdir ref_guided
stringtie -p 1 -G ../chr22_with_ERCC92.gtf -l HBR_Rep1 -o ref_guided/HBR_Rep1/transcripts.gtf HBR_Rep1.bam
所有做相同处理
- Functional Annotation of Assembled Transcripts Using Trinotate
