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研究背景

方案 1

机体内硫醇生物合成机制的正常进行是维持正常生理硫醇浓度水平的必要条件。如方案1，生物体中硫醇的生物合成是由链式反应、多酶催化和多路径交织网络组成的。

鉴于硫醇在生物体中对生理和病理的影响，揭示硫醇的生物合成途径与浓度之间的关系，有利于有效调节体内硫醇浓度，预防硫醇相关疾病的发生。

在生物系统中，正常细胞中Hcy，Cys和GSH的浓度是Hcy的10倍和100倍以上。并且，从方案1可以看出，Cys和GSH在生物合成上密切相关。因此，揭示Cys和GSH的生物合成途径与其浓度之间的内在联系至关重要。

本文工作

作者以α，β-不饱和酮为原料，引入氟化硼作为偶联的二乙胺香豆素和吡喃二酮，设计并合成了一种具有近红外荧光探针。在乙腈和水的混合相中，探针表现出自解离聚集行为，这种自聚集行为导致了探针的吸收光谱在594和372 nm处的吸收峰逐渐减弱，在455 nm处出现了一个新的吸收峰，并且强度逐渐增加。

方案 2

分别在上述三个波长激发下研究了其荧光光谱。当体系中加入3当量的Cys时，594 nm处的吸收完全消失，395 nm处的吸收增强。相应地，该体系的红色荧光被完全猝灭，而青色荧光增强。

当在探针体系中加入30当量的Hcy时，其紫外-可见光谱和荧光光谱与Cys相似。当探针体系中加入200当量的GSH时，594 nm处的吸收仍保持不变，395 nm处的吸收也有类似的增强，荧光光谱与其紫外-可见吸收相对应。

值得注意的是，上述过程的特点是对生物硫醇的快速的响应和探针本身的缓慢的解离聚集，根据这个机理，作者使用该探针监测细胞中的生物硫醇缺乏症。并且，探针对Cys和GSH的敏感性差异可用于研究这两种硫醇生物合成的关系(方案 2)。

图 1

以HCT116细胞为研究对象，对CDB在细胞中的应用进行了研究。15 μM CDB与细胞孵育10 min后，黄色和青色通道出现荧光信号，而红色通道没有荧光信号(图 1a1-a4) ,需要注意的是，黄色信号是由细胞固有的水环境引起的，这一结果也证实了水可以诱导CDB解离聚集和发光。

在随后的实验中，作者在细胞水平上确定不同程度的生物硫醇缺乏症。因此，用H2O2(200 μM)去除内源生物硫醇，然后用15 μM CDB再培养10 min。结果发现，包括红色、黄色和青色在内的三个通道都有荧光发射(图 1b1-b4)。

表 1

在上述体系中，加入一系列不同浓度比的三种外源生物硫醇混合物，继续培养15 min(表 1)。在图2的第4组，出现红色荧光信号，表明Cys缺乏留下了一定量的游离CDB。第8组出现黄色荧光，表明GSH的进一步缺乏使游离CDB大量存在。这些实验结果表明，CDB可以监测Cys和GSH的缺失。

图 2

在接下来的实验中，作者通过酶抑制剂调节细胞内生物硫醇的浓度，实现实时变化。作者使用PAG，CSE和SAS来阻断Cys的产生。

图 3

只用PAG孵育HCT116细胞0-24 h，然后加入CDB(孵育10 min)来监测细胞成像(图 3)。与空白组(仅15 μM CDB)相比，无明显荧光改变，即以青色荧光为主，红色和黄色几乎看不见。这表明细胞内有足够的半胱氨酸与CDB反应，猝灭CDB的红色荧光。

这是因为缺乏的Cys可以通过其他两种途径补充：(A)胞外GGT和DPS可将一定量的GSH水解成Cys，然后通过细胞膜进入细胞内；(B)大量储存在细胞外的Cys2可以被系统XC带入细胞内，并且在Txnrd1下被还原成Cys，用于调节细胞内的Cys水平。

图 4

同样，只用200 μM SAS孵育HCT116细胞进行图像分析。在图 4中，细胞与SAS一起培养0-24 h。与空白组(仅CDB

15 μM)相比，前12 h荧光变化不大。但在接下来的12 h内，红色荧光有微弱的增强，青色荧光强度略有下降。

这一结果表明，SAS比PAG更能阻断Cys的产生，这可能是由于Cys2是Cys的主要来源；但是，GSH和Met合成Cys的过程可能需要一定的时间，因此不能及时补充Cys的不足。尽管如此，这种做法并没有完全切断半胱氨酸的来源。

图 5

因此，作者进一步用PAG和SAS培养细胞，然后加入15 μM CDB进行成像分析。在图 5中，用PAG和SAS处理HCT116细胞3 h后，红色荧光通道显著增加。随后，随着孵育时间的增加，红色荧光强度继续增强，黄色荧光略有增加，但青色荧光急剧猝灭。

以上结果表明，当细胞内Cys低于阈值时，GSH的合成受到抑制。此外，GSH被消耗在细胞内以维持氧化应激，其浓度在没有补充的情况下显著降低。这些结果表明，CDB不仅可以监测细胞内Cys的缺乏，而且证明Cys的持续缺乏会导致GSH水平的降低，说明CDB不仅可以监测细胞内Cys的缺乏，而且还可以证明Cys的持续缺乏会导致GSH水平的降低。

文献原文：Yan, H.; Huo, F.; Yue, Y.; Chao, J.; Yin, C., Rapid Reaction,Slow Dissociation Aggregation, and Synergetic Multicolor Emission for Imagingthe Restriction and Regulation of Biosynthesis of Cys and GSH. J Am Chem Soc 2021, 143 (1), 318-325.

DOI：10.1021/jacs.0c10840