Meike Hu¨dig ,1 Marcos A. Tronconi ,2,† Juan P. Zubimendi ,2 Tammy L. Sage ,3 Gereon Poschmann ,4 David Bickel ,5 Holger Gohlke 5,6 and Veronica G. Maurino 1,*,†
Molekulare Pflanzenphysiologie, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universita¨t Bonn, Kirschallee, Bonn 53115, Germany
摘要
背景：NAD-ME在线粒体中苹果酸呼吸作用中发挥housekeeping的作用，同时在部分C4 lineage植物中，它催化苹果酸脱羧，释放已经固定的CO2，增加Rubisco的催化速率。NAD-ME类型的C4植物存在于大约三分之一的C4植物中（eudicot），多数C4植物中的酶是由单个看家基因的多倍化和新功能化实现的，而C4-NAD-ME是由两个旁系基因分别编码的亚基分别演化而来（α/β NAD-ME）。作者选择cleomaceae中三个C3（Tarenaya hassleriana）和C4（Gynandropsis gynandra，Cleome angustifolia）物种作为研究对象，来探讨C4-NAD-ME的进化/分工之谜。
发现：C4（Gynandropsis gynandra，Cleome angustifolia）中的NAD-ME的β亚基发生加倍，形成两种类型的酶NAD-ME（α/β1）和NAD-ME（α/β2）。在C4脱羧反应中发挥主导作用的是NAD-ME（α/β1）异源聚体（heteromer），在光合作用组织中大量表达。与β2亚基不同，β1亚基无催化活性，且β1亚基与α亚基互作能力更强。两种类型的羧化酶同时存在于线粒体。β1亚基中发生正向选择的氨基酸替换，使得C4植物的线粒体中同时存在不同功能的酶活单位（enzymatic entity）。
预期进行的下一步工作：将导致β亚基新功能化的因素锁定到单个氨基酸。
结果
1.Expression of NAD-ME genes in C3 and C4 Cleome species
无法仅从转录组分析确认C4特有的NAD-ME
2.NAD-ME in photosynthetic and heterotrophic organs of C3 and C4 Cleome
取光合自养/异养组织，提取蛋白，进行非变性凝胶电泳并实施NAD-ME活性检测。发现C4植物中有两个NAD-ME活性heteromer条带。
3.Biochemical properties of recombinant NAD-ME of C3 and C4 Cleome 生化活性分析
4.NAD-MEβ1 evolved as a non-catalytic subunit in C4 Cleome 发现无活性β1亚基
5.GgNAD-MEβ1 stabilizes an associated NAD-MEα subunit 鉴定β1亚基功能
6.Immunolocalization studies 定位分析
结论
文中研究的NAD-ME类型的C4植物，在维管束鞘细胞的线粒体中存在两种不同类型的NAD-ME，其中α亚基是一样的，通过不同的β亚基组成不同的全酶，实现呼吸作用中的苹果酸脱羧和光合作用中C4脱羧作用。
笔记：文中提到一直以来的观点认为C4作用招募的基因会在含有C4特异结构的组织大量表达，但是本文的NAD-ME的表达模式并不符合这一特征，因此如果仅从转录水平入手是无法鉴定专门服务于C4途径的NAD-ME酶的，这也是为何一直都没有相关酶的功能得到鉴定。无催化活性的亚基调控代谢产物分配又多了一个实例。Native-PAGE鉴定NAD-ME酶活后挖胶进行蛋白质谱分析，ORF序列是从cDNA扩增出来的。
