2020-12-08

FastQ格式

FASTQ是一种存储了生物序列(通常是核酸序列)以及相应的质量评价的文本格式。

它们都是以ASCII编码的。几乎是高通量测序的标准格式。NCBI Short Read Archive也是这格式,多了一些描述性词汇而已。

概念

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FastQ格式是序列格式中常见的一种,FASTQ格式的序列一般都包含有四行,第一行由'@'开始,后面跟着序列的描述信息,这点跟FASTA格式是一样的。第二行是序列。第三行由'+'开始,后面也可以跟着序列的描述信息。第四行是第二行序列的质量评价(quality values,注:应该是测序的质量评价),字符数跟第二行的序列是相等的。 [1]

FASTQ格式例子

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@SEQ_ID

GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT

!''((((+))%%%++)(%%%%).1-+''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65

例如在NCBI看到的FASTQ格式如下: [1]

@HWUSI-EAS100R:6:73:941:1973#0/1

GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTT

+HWUSI-EAS100R:6:73:941:1973#0/1

!''((((+))%%%++)(%%%%).1-+''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC6

其中第一行以@开头,后面是reads的ID以及其他信息,例如上例中 HWUSI-EAS100R代表Illumina设备名称,6代表flowcell中的第六个lane,73代表第六个lane中的第73个tile,941:1973代表该read在该tile中的x:y坐标信息;#0,若为多样本的混合作为输入样本,则该标志代表样本的编号,用来区分个样本中的reads;/1代表paired end中的前一个read。

第二行为read的序列。

紧接着下面两行代表该read的质量。

第三行以“+”开头,跟随着该read的名称(一般于@后面的内容相同),但有时可以省略,但“+”一定不能省。

第四行代表reads的质量。这一行可以详细说一下!Illumina测序仪是按照荧光信号来判断所测序的碱基是哪一种的,例如红黄蓝绿分别对应ATCG,那么一旦出现一个紫色的信号该怎么判断呢,因此对每个结果都有一个概率的问题。起初sanger中心用Phred quality score来衡量该read中每个碱基的质量,既-10lgP ,其中P代表该碱基被测序错误的概率,如果该碱基测序出错的概率为0.001,则Q应该为30,那么30+33=63,那么63对应的ASCii码为“?”,则在第四行中该碱基对应的质量代表值即为“?”,ASCii参考如图2。

image.png

一般地,碱基质量从

0-40,既ASCii码为从 “!”(0+33)到“I”(40+33)。以上是sanger中心采用记录read测序质量的方法,Illumina起初没有完全依照sanger中心的方法来定义测序质量,而是把P换成了p/(1-p). 其他完全按照sanger的定义来做。但是他这形式在某些情况下是不准确的,可以看出当测序质量很高的情况下两种形式几乎没区别,但低质量的碱基则有区别了。

格式转换

FASTQ格式与Fasta格式GenBank等格式可以相互转换。格式转换器如下:

Biopython version 1.51 onwards (interconverts Sanger, Solexa and Illumina 1.3+)

EMBOSS version 6.1.0 patch 1 onwards (interconverts Sanger, Solexa and Illumina 1.3+)

BioPerl version 1.6.1 onwards (interconverts Sanger, Solexa and Illumina 1.3+)

BioRuby version 1.4.0 onwards (interconverts Sanger, Solexa and Illumina 1.3+)

BioJava version 1.7.1 to 1.8.x (interconverts Sanger, Solexa and Illumina 1.3+)

MAQ can convert from Solexa to Sanger (use this patch to support Illumina 1.3+ files).

fastx_toolkit The included fastq_quality_converter program can convert Illumina to Sanger

Illumina中应用

图1,Illumina 的 Flowcell

Illmina有多种测序仪,从早期的GA、Hiseq2000、Hiseq2500以及即将推广的Hiseq X,Hiseq2000一个flowcell中包含8个lane,每个lane可以测一个文库或多样本的混合文库,多样本混合文库如果需要后期区分则每个文库需要一个独特的标签,即Index。其中一个lane包含3列(3个Swath),每一列又包含8个tile,每一个tile又会种下不同的cluster,如图1所示为Hiseq2500的FlowCell的一个表面

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