CRISPR/Cas9技术是当下科研圈最炙手可热的技术。而我本身并不是从事基因编辑研究，当实验往前推进时，需要借助已经搭建好的CRISPR/Cas9平台来运用时候，发现了一些问题，这些问题是我整个过程中一步步摸索得出，也是不断的质疑并给出合理解释和解决办法的过程。
1. 基因编辑体系优化：
先前实验室建立的基因编辑，可以实现基因的定向突变，因此沿着之前的步骤进行，却没有检测到突变。所有的后续分析都是建立在之前的体系基础上，不曾怀疑总体的思路体系是否优化。要知道，前人建立体系只是验证了该体系切实可行，并未对体系是否最优化做探索，因此循规蹈矩的重复，并不能解决自己遇到的问题。sgRNA注射浓度、筛选突变的方法等等，都是一个值得优化的地方。
胚胎干燥程度，是胚胎处理的至关重要的环节，干燥不充分不能接纳注射液体，干燥过度则胚胎死亡。所以设计了新的控制干燥程度的设备，来对干燥程度进行更为精准的控制，不在受制于环境温湿度的影响。
一味的追求胚胎注射存活率，是对基因编辑错误的导向。存活率并没有实质性意义，而突变率才是黄金标准。通过提高注射蛋白或sgRNA浓度，加大注射剂量等来提高突变，才是切实可行的办法。
2. sgRNA活性
对sgRNA进行筛选的步骤是体外活性检测，通过体外与Cas9蛋白形成RNP复合体，然后切割DNA片段，依次来评估sgRNA是否有活性。但是体外实验毕竟是体外，并不能模拟体内真是的效果。根据我的实验结论，体外证实高活性的sgRNA有可能在体内表现并不尽人意。但是该方法至少提供了一种评估的办法，所以对待sgRNA活性，也不能一味的依体外效果而盲从，需要活体的进一步验证。
3. 突变体T7E1酶切和测序检测
DNA序列多态性。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每300个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(coding SNP,cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。
正是因为SNP位点是存在，所以野生型DNA的PCR产物，做T7E1酶切，同样可以将DNA剪切成长短不一的DNA片段。尤其是非编码DNA序列的突变，采用T7E1酶切并不可行。
同时，在非编码DNA区域，更是存在着大量的AATT序列，所以采取突变样本的一代测序检测，通过套峰来判断是否突变，也并不可行。
通过设计引物，对SNP或AATT区域进行规避，可以解决部分问题，但是并不适用于一切突变位点。DNA序列上存在大量的酶切位点，NEB等酶制剂公司筛选出了大量的限制性内切酶，是很好的分子工具。突变会更改原先的DNA序列，改变了内切酶的碱基识别序列，所以采用独特的内切酶，能够轻松的识别突变。sgRNA并未严格切割预期的地点，所以突变样本PCR后用sgRNA再次切割验证是否改变sgRNA识别的序列，也是不错的选择。
4. 敲入突变
当数次的突变失败后，也曾怀疑是否机体内非同源末端修复，导致突变的区域又重新修复，所以尝试着提供donor DNA办法。传统提供double strand DNA虽然制备简单，但是效果并不高，更为高效和受推崇的是single strand DNA。可以通过生物公司合成，150nt长度约合人民币3000；也可以采用试剂盒合成，类似的试剂盒价格昂贵且可选择的产品寥寥无几，无奈只能自己制备。所以结合自身的生物学理解提出的RNA-cDNA-ssDNA办法，又契合了已经公开发表的文献。虽说又protocol，但是具体何成途径以及检测ssODN的办法，又没有给出细致的说明。
前后反复试验并对何成产品的质量做了探索性的实验，最后成功制备出真正意义上的ssODN。且筛选出了改进后可以用于纯化ssODN的试剂盒，并且达到一定注射浓度剂量需求。
5. 突变检测实验流程
传统突变检测，存活的个体在产生足够数量的后代后，再采提取G0代DNA，然后PCR扩增，酶切检测或者测序检测。但是从胚胎至产生后代周期约1个月，而且对全部个体提DNA，PCR扩增，酶切检测，真的是time-consuming and laborious。所以亟待通过标记办法来解决实验劳动强度大的问题。
构建标记基因。荧光标记需要大片段插入，虽然截短的EGFP可以使得插入序列更短，但是需要首先构建好分泌型长片段，加之短片段可以翻译并表达，又是一个更为不错的idea。但是距离实际应用相距甚远。Co-CRISPR/Cas9是眼下最为可行的办法，即通过肉眼可见的标记（眼色）和Gene of Interest共注射的办法解决。第一步即对white sgRNA有效性进行筛选，找到了比已发表文献更为高效率的sgRNA，即在G0代就能达到完全白化的效果。通过white眼色基因和GOI共注射，然后在眼色突变的存活后代中检测GOI突变，可以极大缩小范围，减轻实验劳动强度。
综上，没有信手拈来的借用，做科研上更是忌讳一味的'拿来主义'，不能全盘照抄而不假思索，看似简单平常的步骤都凝聚了实验人员的大量实验付出，有更多值得深究的技术问题，这也告诫自己，学会独立思考和分析。任何时候都要保持思想的独立，在旁征博引的同时要摆脱前人的思维框架和体系，汲取有益成果并能推陈出新，做出自己的真正意义上的科学结论。
