磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）是丝氨酸合成途径中的关键限速酶，催化3-磷酸甘油酸转化为3-磷酸羟基丙酮酸，同时将NAD⁺还原为NADH。
1. Metabolomic and transcriptomic analyses reveal that PHGDH-mediated serine biosynthesis is a major upregulated metabolic pathway in tumor ECs
为了探究肿瘤条件下的内皮代谢变化，作者从glioma患者手术组织和对照样本中分选了CD31+内皮细胞，进行了质谱检测，结果显示存在显著变化(a)。进一步分析显示肿瘤EC存在glycine, serine, 和 threonine 代谢通路的富集(b)。接着作者对两组内皮进行了转录组测序，并进行了KEGG的代谢通路富集分析（65个代谢通路）。结果显示多个代谢基因发生改变(c左)。在检测到的403个代谢基因中，(1) cysteine biosynthesis from serine 和 (2) serine biosynthesis
from 3-P-glycerate是最在肿瘤EC中最显著的两条通路(c)。而在这两条通路中，磷酸甘油酸脱氢酶PHGDH 和 CBS (cystathionine-b-synthase) 是最显著变化的两个代谢基因(d)。Considering that PHGDH is a rate-limiting enzyme catalyzing the committed step in de novo serine synthesis, we focused our study on PHGDH. WB也验证了PHGDH在肿瘤内皮中的表达(e,f)。
2. Single-cell RNA-seq analysis uncovers a critical role of PHGDH for cell cycle and proliferation regulation preferentially in tumor ECs
为了探究PHGDH在EC中的功能，作者使用了内皮示踪小鼠(cdh5 cre上带tomato)。接着构建了GBM模型，并分选了tdTomato+肿瘤内皮进行单细胞测序(b)。结果显示肿瘤内皮Phgdh表达显著上调(c)，且肿瘤内皮增殖性更强(d)。肿瘤内皮Phgdh表达在增殖细胞中更强，尤其是在S期肿瘤内皮中(e)。轨迹分析中，肿瘤内皮Phgdh的表达与Mki67, Top2a, Pcna 和 Cenpu 等增殖基因趋势一致，而正常内皮中未观测到这种现象(f)，提示Phgdh在肿瘤内皮中参与细胞增殖。在已报道的人类GBM肿瘤单细胞数据中，肿瘤内皮PHGDH的表达也与Mki67的表达相关(g-i)。
Together, these results suggest a putative role of PHGDH for cell cycle and proliferation regulation selectively in tumor ECs but not in normal ECs or tumor cells.
3. PHGDH is required for cell viability and proliferation selectively in tumor ECs
为了探究PHGDH在肿瘤EC中的作用，作者敲低了PHGDH并进行了转录组测序(j, k)。结果显示富集到的top通路与细胞增殖分裂相关(l)。接着作者在体外探究了PHGDH对细胞增殖的影响，发现PHGDH抑制剂WQ2101 和 WQ2201抑制了肿瘤内皮而不是正常内皮的viability(m)。而在ex vivo共培养实验中，WQ2201显著抑制了U251 human glioma cells诱导的肿瘤EC生长(n)。
4. PHGDH regulates redox homeostasis and glycolysis
此前有研究报道PHGDH可以通过提供serine依赖的合成代谢促进恶性肿瘤生长，并在生理和发育环境下促进内皮中核苷酸和亚铁血红素合成。为了探究PHGDH在肿瘤ECs代谢和增殖中的作用，作者探究了PHGDH抑制对carbon flux 和 redox balance 的影响。
在代谢流分析中，M+0、M+1和M+2是指同位素标记的不同状态：
- M+0：表示没有同位素标记的分子。
- M+1：表示分子中有一个同位素标记，通常是指一个碳原子被替换为其同位素（如碳-13）。
- M+2：表示分子中有两个同位素标记，通常是指两个碳原子被替换为其同位素。
这些标记状态用于分析代谢物在代谢通路中的流向和分布
Isotope tracing analysis结果显示WQ2201降低了[U-13C] glucose-derived carbon flux 生成 serine 和 glycine(b左图)，尤其是在干预早期(b右图)。但是并不影响外源性serine-derived flux into glycine (丝氨酸的m+3和甘氨酸的m+2显著增加，m+0不变)，证实了 PHGDH 的在 de novo 丝/甘氨酸de novo合成中的限速作用(a, b)。尤其是，WQ2201抑制了葡萄糖的carbon flux 和TCA循环(c-d)，核苷酸合成同样出现下降，磷酸戊糖途径中m+2, m+3和m+4都下降 (as indicated by decreases in the incorporation of lactate and TCA metabolites from glucose, e图)。2-hydroxyglutarate (2-HG, 2-羟戊二酸)是glioma中起到免疫抑制的肿瘤代谢物，可以作为TCA的副产物被LDHA或MDH1/2合成，或被PHGDH从a酮戊二酸产生。值得注意的是，PHGDH抑制显著降低了从葡萄糖到2-HG的carbon flux (f)。此外，WQ2201抑制了ADT, ATP, UDP和UTP的incorporation from glucose(g)，提示其破坏了glucose-derived nucleotide biosynthesis，降低了细胞ATP和UTP水平和TCA的carbon flux (附图)。
与PHGDH在serine生物合成中的必需作用相一致，WQ2201显著降低了细胞总GSH (GSH+GSSG; GSSG, the oxidized form of GSH) 和GSH/GSSG (h, i)。此外，由于PHGDH消耗3-PG (3磷酸甘油酸)和NAD+，生成3-phosphohydroxypyruvate和NADH，作者的结果显示WQ2201降低了细胞NADH水平，NAD+/NADH升高 (j, k)，提示肿瘤内皮中的PHGDH参与调节redox homeostasis。这些结果提示PHGDH调节核苷酸合成，central carbon flux, 和 redox homeostasis，从而参与肿瘤内皮增殖。
为了证实这个假说并探究哪个代谢过程可能参与调控PHGDH抑制对细胞增殖的调节作用，作者在WQ2201处理条件下，使用了多种与PHGDH相关的代谢物干预serine/glycine-deprived tumor ECs，包括a-KG, 2-HG, nucleosides, formate, hemin, 和 antioxidants。结果显示只有添加nucleosides 和 antioxidants，包括dithiothreitol, N-acetylcysteine, 和 GSH，部分挽救了PHGDH抑制引起的内皮增殖(l)，提示PHGDH在肿瘤内皮细胞增殖中的两个重要作用是promote nucleotide synthesis 和 keep redox balance。
有趣的是，GSH supplementation 在PHGDH抑制条件下，恢复了3-PG, PEP和pyruvate carbon flux水平，表明其可以rescued glucose incorporation into glycolysis，而不是TCA循环 (m)，提示PHGDH regulates redox to selectively modulate glycolysis。
总而言之，这些结果提示PHGDH促进 nucleotide 生物合成，维持 redox 稳态，从而 support preferential glycolysis，引起肿瘤EC的增殖。
谷胱甘肽（glutathione，r-glutamyl cysteingl +glycine，GSH）是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由
谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成
GSSG (Oxidized glutathione)是谷胱甘肽(GSH)的氧化二硫键形式
5. Tumor microenvironmental cues activate ATF4, inducing PHGDH expression
接着作者探究了肿瘤内皮中PHGDH上调的机制。分析发现有90个TFs可能结合于PHGDH的启动子区，其中ATF4相关基因变化最显著(a,b)。因此作者敲低了ATF4及其伴侣蛋白NRF2，发现可以降低PHGDH的表达(c, d)。使用ISRIB抑制ATF4同样可以降低PHGDH的表达(e)。随后作者使用ChIP-qpcr检测了其结合位点(f)。其他体外模型如VEGF-A诱导、低氧或丝/甘氨酸剥夺，都可以刺激肿瘤内皮中ATF4依赖的PHGDH表达(g-h)，而且主要结合于其顺式作用元件(i, j)。ATF4抑制剂可以在肿瘤内皮细胞而不是正常内皮中抑制增殖(k)。
6. Genetic PHGDH ablation reduces vascular aberrancy, improves T cell infiltration, and inhibits GBM growth
接着作者构建了内皮特异性的PHGDH敲除鼠。由于纯合致死，作者使用的是tamoxifen诱导的杂合鼠(a)。接着作者构建了GBM肿瘤模型(b)。结果显示内皮特异性PHGDH敲除降低了肿瘤小鼠死亡率(c)，肿瘤生长同样受到抑制(d)。为了探究Phgdh敲除对内皮细胞的影响，作者使用了内皮Phgdh敲除-内皮tdTomato标记鼠(e)。结果显示Phgdh KD 引起了vessel pruning，血管结构不再如肿瘤组织中一般混乱，血管腔容积、大小和长度都下降(f)。此外，Phgdh KD 使得intratumoral hypoxia下降了90%(f)，提示灌注增加改善了肿瘤免疫微环境。肿瘤组织中的T细胞也出现显著增加(g)。
Together, these results suggest that endothelial PHGDH is critical for vascular aberrancy, intratumoral hypoxia, inhibition of T cell infiltration, and tumor growth.
7. PHGDH inhibition prunes tumor vasculature and improves T cell infiltration and activation
接着作者使用内皮tdTomato标记鼠探究了PHGDH抑制剂WQ2201的治疗效果，发现其缓解了肿瘤中内皮细胞的异常增生，增加了肿瘤中的T细胞浸润。
8. PHGDH inhibition improves CAR T immunotherapy in two preclinical mouse GBM models
由于PHGDH抑制可以减轻缓肿瘤中内皮细胞的异常增生，增加了肿瘤中的T细胞浸润，作者探究了PHGDH抑制对CART治疗的影响，发现其可以改善CART治疗效果。
