农杆菌侵染拟南芥的转化方法

1、野生型拟南芥培养

植株健壮、在初花期侵染效果最好。

野生型拟南芥培养至抽薹开花,转化前一周左右保持土壤稍微干。

在转化前1-2天将开过的花朵和荚果剪掉,培养基质浇水浇透。

2、制备转化用的农杆菌菌液

在灭菌15-20分钟后的超净台中,往灭菌 500mL三角瓶中加入液体LB 200mL、50ng/μL Kan加200μL、20ng/μL Rif 加200μL、200-300μL农杆菌菌液,于28℃摇床180rpm培养至LB呈橙汁色。

3、侵染

将200mL菌液分装到6个50mL离心管中,4000rpm离心15min,倒掉上清。

配置400mL 5%蔗糖溶液(20g蔗糖加ddH2O定容至400mL),再加入60μLSilwet L-77(表面活性剂,终浓度0.03%),混匀。

往6个50mL离心管分别加入25mL5%蔗糖溶液(含0.02%silwet L-77)把菌体混匀洗脱后倒入大皿中,以5%蔗糖溶液(含0.02%silwet L-77)作对照,用5%蔗糖(含0.02%silwet L-77)稀释至OD600 =0.8-1.0。

(另一种拟南芥转化缓冲液配方:2.2 g/L MS, 0.5 g/L MES, 50 g/L 蔗糖, PH调至5.8;加表面活性剂silwet L-77,浓度25、30、35、40 μL/100 mL; 搅拌均匀。这种配方效果更好。)

转化时将花骨朵在溶液中浸泡3-5min左右,将转化好的苗平放于盒子内,不要让侵染液滴到叶片上,否则叶片会死亡。同时尽快放入暗箱,覆膜保湿,避免花序风干。侵染期间注意保温。暗培养24h后,将植株立起正常培养,每三天浇水一次。

二次侵染根据植株的生长状况而定,一般每隔5-7天侵染一次,侵染三次。

Silwet L-77有毒,破坏质膜,使用时戴手套。

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