今天给大家带来一个老套路文章，文章分析方法其实都是大家已经司空见惯的方法，但是它为啥能发到6分多，让我们一起去探个究竟~
研究背景
目前已经有研究表明，TP53突变可预测胃癌患者整体生存和无复发生存期。虽然TP53突变影响胃癌患者预后已得到证实，但其对STAD患者免疫功能的具体影响尚未得到充分研究。
方法及结果
➀ TP53在胃癌样本中的突变情况
从TCGA数据库中下载胃癌（STAD）突变数据、临床数据、基因表达数据。对STAD的基因的突变频率进行统计，结果发现TP53排名第二。
➁ TP53突变对免疫功能影响
将STAD样本分为TP53突变组和TP53野生组。两组样本的基因表达数据进行基因富集分析（GSEA）。结果发现有7个免疫相关的通路富集在TP53野生组，TP53突变组没有免疫相关通路富集。
➂ 建立免疫相关预后模型
上述GSEA分析中7个免疫相关通路共包含766个基因。单因素Cox回归分析，结果显示有45个基因与预后相关。LASSO回归分析、多因素Cox回归分析、最终筛选出9个基因。用这9个基因建立预后模型，公式：Risk score = ECAMK4*0.456 + ECYP19A1*0.823 + EZFP36*0.195 + ECLCF1 *0.226 + ECACTIN *(−0.653) + ENRARP*(−0.170) + ECFHR4*1.050 + EAMBP* 0.181 + EFBN1*0.149。模型测试结果（TCGA数据测试，图ABC）和验证结果（GEO数据验证，图DEF）如下图所示。该预后模型对1、3、5年的整体生存的预测AUC值均能达到0.5以上，说明该模型的预测效果良好。
➃ 根据TP53突变状态进行预后特征的生存分析
TCGA数据库中STAD样本的总体生存和TP53的图片没有显著相关性（图A）。为了验证预后模型是否独立于TP53突变，作者将样本STAD分为了两种亚型：TP53突变型和野生型，发现预后模型能够很好的预测这两个亚型的患者的预后（图BC）。由于不同类型的TP53突变通常会导致不同的生物学后果，作者分析了TP53各类突变与STAD患者预后之间的关系，然而，结果表明TP53突变并不影响STAD患者的预后。作者将TP53突变频率最高的类型（missense mutation subgroup）的样本提出来，发现预后模型对该亚型的预后也有很好的预测效果（图E）。
➄ STAD患者的免疫状况
为了探究预后模型的免疫特性，作者应用ESTIMATE计算STAD样本的基质评分、肿瘤纯度、免疫评分和ESTIMATE评分。将预后模型计算的风险分数和上述评分进行相关性分析，结果表结果发现风险分数与基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分呈正相关，与肿瘤纯度呈负相关（图ABCD）。此外，作者还研究了低、高风险STAD患者基质评分、肿瘤纯度、免疫评分和ESTIMATE评分的差异。高风险患者的免疫、基质和ESTIMATE评分均高于低风险患者，肿瘤纯度低于低风险患者(P < 0.05，图EFGH)。
➅ 患者的浸润免疫细胞情况分析
肿瘤浸润免疫细胞比例和水平的变化可能代表不同个体的内在特征。CIBERSORT估算高风险组和低风险组患者的22种免疫细胞组成（图A）。22个肿瘤免疫细胞呈弱或中度相关（图B）。高风险组和低风险组患者的免疫细胞组成进行比较，发现高风险组STAD患者的单核细胞、M0巨噬细胞和滤泡辅助T细胞比例显著高于低风险组，静息树突状细胞和CD4记忆激活T细胞比例显著低于低风险组(P < 0.05，图C)。
➆ 预后模型与免疫检查点关系分析
免疫检查点药物已被证明具有逆转肿瘤免疫抑制作用的抗肿瘤作用，因此作者分析了风险分数与不同免疫检查点蛋白(PD-L1, PD-1, CTLA-4, TIGIT, LAG-3 and TIM-3)表达水平的相关性。结果发现风险分数与与TIM3和BTLA显著相关（图AB）。近一步的分析表明高风险患者TIM3和BTLA的表达明显高于低风险患者(P < 0.05)(图6C和D)。以上结果提示高风险患者不良预后可能与免疫抑制微环境有关。
➇ STAD富集通路分析
以logFC > 1和FDR < 0.05为阈值选择低风险和高风险患者差异表达的免疫基因。筛选与风险分数有显著相关性的的基因（Pearson相关系数> 0.2和P < 0.05）。一共筛选到39个基因（图E）。对l这39个基因进行GO和KEGG分析，结果发现STAD中与风险分数相关的基因主要富集于免疫效应过程的调控、体液免疫反应的调控、体液免疫反应的调控、ECM受体相互作用等(图6F和G)。
⑨ 基于预后模型的列线图构建
单因素、多因素Cox回归分析，发现预后模型可以作为独立的预后因素。nomogram生存预测模型具有良好的预后。
相信大家看到这里也能明白本文为啥能发6分多了。和别的文章不同的是，本文特征基因的筛选、预后模型的建立只是文章的一小部分，文章大量的分析都在探究预后模型与免疫之间的关系，分析细致、紧贴主题，是文章的一大亮点。另外由一个单基因引发的一系列研究，也是文中的一大亮点，老师们如果有想要研究的单基因，也可以尝试这种思路~
