双脱氧法或酶法利用DNA 聚合酶合成单链DNA 模板的互补拷贝，这一方法最先由F. Sanger 及其合作者发展而来。DNA 聚合酶不能起始DNA 链的合成，而是在复性于“模板“DNA 的引物的3 ‘端上进行链的延伸（图1) 。链的延伸是在引物生长端的3′羟基掺入脱氧核糖核苷酸。双脱氧测序法利用了DNA 聚合酶能以2′, 3’－双脱氧核糖核苷酸(ddNTP) 为底物的特性。当ddNTP被掺入到延伸着的引物的3′ 端时，由于链上3′ 羟基的缺乏，链的延伸就会终止。在4 个测序反应的每个反应中加入4 种可能的ddNTP中的一种，即可产生4 种不同的反应。调整每个测序反应中的ddNTP 与dNTP的比例，使部分引物延伸链分别终止于每一个在模板DNA出现该碱基的位置上。这种测序方式，每个延伸反应的产物是一系列长短不一的引物延伸链，它们都具有由复性引物所决定的固定的5’端和终止于某一ddNTP的不定的3’ 端。
常用的双脱氧测序法有两种常用方案。最早期的双脱氧法，称之为Sanger 法(Sanger et al. 1977, 1980) ，是利用大肠杆菌DNA 聚合酶I 的Klenow 片段而发展起来的 。引物在需要测序的单链DNA 模板的3′ 端进行复性（图1)。分成4份进行反应，每一份反应中都含有DNA 聚合酶、3 种未标记的dNTP、一种标记的dNTP 及其相应的ddNTP （图1 右侧）。引物的延伸和标记进行至摄入ddNTP 后被终止。在接下来的反应中，追加高浓度的4 种dNTP 使未被ddNTP 终止的链再延伸
以产生更高分子质量的DNA, 这种DNA 链滞留在测序胶的顶部无法分辨。测序产物的平均长度通过ddNTP/dNTP 的比率来控制，比率越高产物越短。
标记／终止法利用修饰的T7 噬菌体DNA 聚合酶得到进一步发展。在两个独立的反应中分别进行引物的标记和双脱氧核苷酸的掺入（图 1左侧）。复性的引物在4 种低浓度dNTP（其中1 种是放射性标记的）存在时进行延伸。DNA 的合成持续到一种或多种dNTP被耗竭为止，这样可保证掺入全部的标记的脱氧核糖核苷酸。标记的混合物分到4 个独立的反应中，每个反应除了含有4 种dNTP 外，还各含4种ddNTP 中的1种。在链终止反应步骤中，高浓度的dNTP 保证DNA 逐次合成至生长链因ddNTP的掺入而终止。测序产物的平均链长取决于标记反应中dNTP 的浓度（浓度越高产物越长）和终止反应中ddNTP : dNTP 的比例。
当使用测序酶的时，标记／终止法能得到平均长度长于Sanger法的测序产物。所以这种方法对于从每个模板上获得最大散序列的信息是更有利的。对于测定小片段DNA（如证实结构）， Sanger法通常就足够了。如确定引物后几个核苷酸的序列信息， Sanger 法则更可靠。热稳定的DNA 聚合酶也可以用于双脱氧测序。因为耐热DNA聚合酶可以在高温下工作，可以用它进行热循环反应，这样可以提高测序产物的产量，因而提高了灵敏度。此外，热稳定聚合酶可以使DNA模板的二级结构变性，而DNA 的二级结构会干扰延伸进程。
