浪淘沙·DoTK

莫道磷酸如浪深

莫言酪氨似沙沉

超亲富集不辛苦

吹尽狂沙始到金

摘要

三个肿瘤细胞系分别检测到约1300 - 3000个pY位点，酪氨酸激酶(TK)数在15-47个之间

双重复样本有多达1155-2364个位点可重复检测，定量相关系数R高达0.74-0.84

K-Score算法精准预测激酶活性，TK进化树可视化展示数据。

酪氨酸磷酸化是药物靶点与信号通路研究中最重要的蛋白翻译后修饰，没有之一。特别是肿瘤药物，免疫药物，所涉及的靶点和通路绝大部分受酪氨酸激酶调控，其中大部分是由酪氨酸激酶直接介导。长期以来，对酪氨酸磷酸化的研究只能依赖磷酸化蛋白的抗体，以极低的通量去研究[1]。磷酸化位点的抗体特异性差，很多甚至没有抗体。

质谱技术可以无偏，全面，高通量的检测蛋白的磷酸化水平。遗憾的是，金子般的酪氨酸磷酸化 (pY) 信号只占到所有磷酸化的~0.1% [2]，湮没在占比达99.9%的丝苏氨酸磷酸化的黄沙之中。传统的Fe, Ti金属离子富集磷酸化的技术即使在10000个位点的检测深度，也只能检测到~10个左右的pY位点。这仅有的10个位点，且不说定量准确性，重现性很差，它们所代表的高丰度信号意义非常有限。

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也有学术界实验室试图通过pY特异的抗体 (pTyr-100, pTyr-1000等) 去富集检测。但抗体作为多达1000个氨基酸以上的超大分子，去区分并富集只有一个磷酸根区别的酪氨酸侧链，颇有一点挖掘机摘花瓣的味道。其定量准确性，稳定性，重现性，都很难实现。再加上抗体天生的批次差异性和高昂的生产成本 [3]，抗体富集pY一直局限于少数实验室小规模的课题检测。工业化或大队列的pY抗体富集鲜有报道。

DeepKinase的DoTK技术平台，利用专利技术SH2 Superbinder超亲体富集pY，首次实现了稳定，特异，可重现的工业级pY组学检测 [4]。基于检测到的磷酸化信息，辅以DeepKinase独有的K-Score激酶活性预测算法，我们对样本的激酶活性进行全面评估和深度挖掘，为药物发现与开发，临床诊断和干预提供全新的视角。

为了测试SH2 Superbinder的富集效果，我们选用了三个肿瘤细胞系：

MKN45：人胃癌细胞

A549：人肺癌肺泡基底上皮细胞

Ramos:  人B淋巴细胞瘤细胞

经过过氧化氢和过钒酸钠处理后的细胞沉淀样品，进行提取蛋白和酶切处理后，统一采用起始量为200ug的总肽段进行磷酸化酪氨酸肽段的富集。两次生物重复，采用不同的质谱平台测试分析。每个样本都是一次进样，没有进行分级增加鉴定深度，同时增加了定量准确性。（原始数据已上传到PRIDE: PXD037088）。

如图所示，这六个样本我们分别检测到约1300 - 3000个pY位点。MKN45细胞的pY位点数最丰富。其中检测到的酪氨酸被磷酸化的酪氨酸激酶(TK)数在15-47个之间（人类基因组有约90个酪氨酸激酶[5]）。TK最多的是A459细胞。可推测，MKN45用较少的酪氨酸激酶种类，实现了较广较高的总体酪氨酸磷酸化水平。而A549虽然更多酪氨酸激酶活化，却只有较窄较低的总体pY水平。

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两个生物学重复的数据高度相关，体现了技术在高鉴定深度下的高重现性。

首先，Venn维恩图表明，在定性水平，多达1155-2364个位点可在两个重复样本中同时检测到。

接着，散点图表明，在定量水平，相关系数R高达0.74-0.84。

高鉴定深度下的高重现性为量化统计分析提供了可信可靠的数据基础。

梅须逊雪三分白，雪却输梅一段香

三个不同的细胞系都是能够无限生长的癌细胞系，又来源于不同的个体和组织器官。我们能通过酪氨酸磷酸化数据看到怎样的个性与共性呢？

首先，下图表明，这三个细胞系有共同的565个pY位点，也有各自独有的322~1923个位点。

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接着，通过DeepKinase独有的K-Score激酶活性预测算法，我们可以预测出三个细胞系共55个TK的活性，其中28个为细胞系特异性激活的，体现了不同细胞系的激酶谱特征。

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Ramos作为免疫来源的B淋巴细胞系，其BTK, SYK, HCK，ZAP70等免疫细胞特异的酪氨酸激酶高度活化，而肺癌的A549和胃癌的MKN45则分别是RET, BMX, PTK2, ABL2和MET, EGFR, MST1R, SRC等激酶高度活化。的确，文献报道，Ramos对BTK抑制剂敏感[6]， A549可以通过联用JAK抑制剂来克服EGFR抑制剂的耐药[7]，而MKN45对MET抑制剂是高度敏感的[8]。

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通过激酶活性的分析，我们找到了细胞系特异的活性激酶，并可以在文献中找到部分的验证。其他被预测到，暂时没有文献研究验证的新靶点值得去探索与研究。

从2001年“药神之药”格列卫上市到2020年的20年间，FDA共批准了71个激酶靶向药，其中44个是酪氨酸激酶抑制剂 [9]。日益增加的研发管线和临床试验在不断推出更多的新靶点的抑制剂，老靶点的新一代药物，和现有药物的新适应症。

[References]

Phosphorylation State-Specific Antibodies. 2003 Mandell

Phosphotyrosine – a new protein modification 1982 Hunter

Quality Issues of Research Antibodies. 2016 Weller

Ultra-deep tyrosine phosphoproteomics enabled by a phosphotyrosine superbinder 2016 Bian et al.

The protein tyrosine kinase family of the human genome 2000 Robinson et al.

Next-generation Bruton's tyrosine kinase inhibitor BIIB091 selectively and potently inhibits B cell and Fc receptor signaling and downstream functions in B cells and myeloid cells 2021 Bame et al.

Inhibition of JAK1/2 can overcome EGFR-TKI resistance in human NSCLC 2020 Kim et al.

Signaling networks assembled by oncogenic EGFR and c-Met 2008 Guo et al.

Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design 2021 Attwood et al.