我们经常看到：
seurat_obj <- FindVariableFeatures(object = seurat_obj, selection.method = "vst", nfeatures = 2000, verbose = F)
seurat_obj <- ScaleData(object = seurat_obj)
seurat_obj <- RunPCA(object = seurat_obj, features = VariableFeatures(object = seurat_obj))
seurat_obj <- RunUMAP(seurat_obj, dims = 1:30)
各步骤的解释及参数说明
1. NormalizeData()
作用: 归一化数据，调整不同细胞的测序深度差异。
默认参数解释:
• normalization.method = "LogNormalize": 对每个基因的 UMI 计数除以该细胞中总的 UMI 计数，并乘以一个比例因子（默认10,000），然后取自然对数。
• scale.factor = 10000: 这是归一化的比例因子，用来调整每个细胞的总表达量。
必要性: 归一化是为了使不同细胞的测序深度可比，从而消除技术上的差异，强调生物学差异。
2. FindVariableFeatures()
作用: 选择高变异的基因，后续分析（如 PCA）主要关注这些基因。
参数解释:
• selection.method = "vst": 使用方差稳定转换方法（vst）来选择高变异基因。
• nfeatures = 2000: 选择的高变异基因数量，默认是2000个。
• verbose = FALSE: 控制是否显示运行信息。
必要性: 选择高变异基因能够提高降维分析的信噪比，从而更好地捕获生物学信号。
3. ScaleData()
作用: 将数据中心化并标准化，使其在后续分析中具有相同的尺度。
默认参数解释:
• features: 默认对所有基因进行标准化。如果指定特定的基因集，只对这些基因进行标准化。
• vars.to.regress: 如果需要对某些变量（如细胞周期、线粒体基因）进行回归，可以指定这些变量。
必要性: 在降维分析（如 PCA）中，标准化可以确保不同基因的表达水平在相同的尺度上进行比较，否则高表达基因会主导结果。与 NormalizeData 的区别: NormalizeData 是对不同细胞的总表达量进行调整，而 ScaleData 是在细胞内部对基因的表达进行标准化，消除基因间的量纲差异。
4. RunPCA()
作用: 主成分分析（PCA），将高维基因表达数据降维到少数几个主成分。
参数解释:
• features: 使用 VariableFeatures 中筛选出的高变异基因进行 PCA。
• npcs: 默认提取前50个主成分。
• verbose: 控制是否显示运行信息。
必要性: PCA 是常用的降维方法，有助于识别数据中的主要变化模式，方便后续聚类或可视化。
5. RunUMAP()
作用: 使用 UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）算法，将高维数据降维到二维或三维空间以便可视化。
参数解释:
• dims = 1:30: 使用前30个主成分作为输入维度进行降维。
• min.dist: 控制聚类的紧密度，默认值为0.3，值越小聚类越紧密。
• n.neighbors: 控制近邻数，默认值为30，影响局部结构的捕获能力。
必要性: UMAP 能够在保持数据全局结构的同时更好地保留局部结构，使得不同群体的分离更清晰，便于可视化和解释。
总结
• NormalizeData 是为了调整细胞间的总表达量差异；
• ScaleData 是为了标准化基因间的表达水平，使得后续分析更为可靠。
每一步都为后续的降维、聚类或可视化打下基础，确保数据能够更好地反映真实的生物学差异。
让我们通过一个具体的例子来更清楚地说明 NormalizeData 和 ScaleData 的区别和它们的作用。
1. NormalizeData 的解释和示例
场景：
假设我们有两个细胞 A 和 B，以及两个基因 G1 和 G2，它们的原始 UMI 计数如下：
| 细胞/基因 | G1 | G2 | 总计 |
|---|---|---|---|
| A | 100 | 50 | 150 |
| B | 300 | 150 | 450 |
• 细胞 A 和 B 的总 UMI 计数分别为 150 和 450。可以看出，细胞 B 的测序深度是细胞 A 的三倍。
• 直接比较两者可能会因为测序深度不同而得出错误的结论。
归一化步骤：
• 我们将每个基因的 UMI 计数除以该细胞的总 UMI 计数，并乘以一个比例因子（假设是10,000），然后取自然对数。
对细胞 A：
• G1: (100 / 150) * 10000 = 6667，取对数后得到约 8.8
• G2: (50 / 150) * 10000 = 3333，取对数后得到约 8.1
对细胞 B：
• G1: (300 / 450) * 10000 = 6667，取对数后得到约 8.8
• G2: (150 / 450) * 10000 = 3333，取对数后得到约 8.1
结果：
| 细胞/基因 | G1 | G2 |
|---|---|---|
| A | 8.8 | 8.1 |
| B | 8.8 | 8.1 |
通过归一化，我们调整了细胞间的测序深度差异，现在可以公平地比较基因表达水平。
2. ScaleData 的解释和示例
场景：
在进行 PCA 或其他降维分析时，基因 G1 和 G2 的表达量范围可能差异很大。如果不标准化，表达量高的基因会主导分析结果。
假设有以下归一化后的表达数据（已省略自然对数步骤）：
| 细胞/基因 | G1 | G2 |
|---|---|---|
| A | 5000 | 300 |
| B | 5000 | 300 |
| C | 4000 | 200 |
| D | 4500 | 250 |
可以看到 G1 的表达水平比 G2 高很多，这可能会导致降维分析只关注 G1 的变化。
标准化步骤：
ScaleData 的目标是将每个基因的表达水平中心化（减去均值）并标准化（除以标准差），使得所有基因在相同尺度上变化。
假设 G1 和 G2 的均值和标准差如下：
• G1: 均值 = 4625，标准差 = 500
• G2: 均值 = 262.5，标准差 = 50
标准化后的表达数据为：
• 对于 G1，细胞 A 的标准化值是 (5000 - 4625) / 500 = 0.75
• 对于 G2，细胞 A 的标准化值是 (300 - 262.5) / 50 = 0.75
标准化结果：
| 细胞/基因 | G1 | G2 |
|---|---|---|
| A | 0.75 | 0.75 |
| B | 0.75 | 0.75 |
| C | -1.25 | -1.25 |
| D | -0.25 | -0.25 |
现在，G1 和 G2 处于相同的尺度上，PCA 会公平地考虑这两个基因的变化，不会被一个高表达的基因主导。
总结
• NormalizeData: 主要解决细胞间的测序深度差异，确保所有细胞的总表达量在一个可比的水平。
• ScaleData: 主要解决基因间表达水平的差异，确保每个基因在相同尺度上被分析。
通过这两个步骤，我们能更准确地比较不同细胞的基因表达模式，并为后续的降维、聚类和可视化打下基础。
