1️⃣ 核蛋白（Nuclear proteins）
如：NF-κB p65、p-p65、GATA4、p53、Histone 家族
特点： 量少、易降解、磷酸化敏感
WB重点：
❗必须严格使用 核提取（NE-PER 或高盐法）
加PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂
转膜不要太久：0.2 μm PVDF 优先
封闭建议 低背景快速封闭液（10 min） 可避免核蛋白的高背景问题
2️⃣ 细胞膜蛋白（Membrane proteins）
如：EGFR、Na⁺/K⁺ ATPase、受体类
特点： 疏水性强、难溶
WB重点：
裂解缓慢 ⇒ 需要 RIPA + 1% Triton X-100 或 SDS 缓冲
电泳容易跑得慢、拖尾
转膜最好 延长时间或提高电流
❗封闭要用低背景型，普通奶粉容易导致膜蛋白背景高
3️⃣ 细胞质蛋白（Cytosolic proteins）
如：GAPDH、β-actin、Tubulin
特点： 稳定、量大、好跑
WB重点：
基本不挑体系
内参常用选择
标准 RIPA 足够
你新体系的“干净背景 + 条带锐利”在细胞质蛋白上效果会特别明显。
4️⃣ 线粒体蛋白（Mitochondrial proteins）
如 COX IV、TOM20
特点： 多跨膜结构
WB重点：
裂解液需比较“暴力”：RIPA + SDS
转膜需更强电压或湿转
条带常偏粗 ⇒ 尽量用 12–15% 胶
5️⃣ 分泌蛋白（Secreted proteins）
如 IL-6、MMP9、激素类
特点： 在细胞外，浓度很低
WB重点：
需要收集上清，浓缩（10K/30K 过滤柱）
条带可能弱 ⇒ 一抗浓度需要高一些
胶浓度 10% 或以下可避免低分子量跑过头
6️⃣ 磷酸化蛋白（p-protein）
如 p-p38、p-ERK、p-AKT
特点： 极不稳定
WB重点：
❗采样必须加 磷酸酶抑制剂
全程低温
电泳 不宜过热 → 你之前问的“发热”问题就和它关系最大
封闭一定要 10 min 快速封闭液（奶粉含磷酸会干扰）
7️⃣ 高分子量蛋白（>200 kDa）
如：凝血因子、某些受体
特点： 不好迁移
WB重点：
建议湿转 > 2 h
低百分比胶（6–8%）
一抗孵育时间要长
8️⃣ 低分子量蛋白（<15 kDa）
如：小肽激酶、某些核小蛋白
特点： 容易跑出胶
WB重点：
15–20% 胶
注意转膜用 0.2 μm，时间不能太久
膜蛋白快速封闭液也能防止背景遮盖
