PART ONE
什么是Western Blot
- What is Western Blot -
WB实验基于抗原-抗体的特异性结合，主要通过分离蛋白、转移到支持膜并检测目标蛋白信号来实现对目标蛋白的定性或定量分析。
3
核心流程
样品准备
SDS-PAGE电泳
转膜
封闭
抗体孵育
检测和显影
PART TWO
样品准备
- Sample Preparation -
1
原理 >>
细胞或组织中，蛋白质被多种成分（脂质、核酸、糖类等）包裹，需通过裂解和变性将其提取出来并保持稳定性。
2
操作与解析 >>
裂解：
使用RIPA裂解液等去污剂溶解细胞膜，释放蛋白质。
同时加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，避免降解或去磷酸化。
冰浴操作减少蛋白降解。
离心：
将裂解液超速离心，去除不溶性碎片和细胞核，收集上清液（含目标蛋白）。
定量：
通过BCA或Bradford法测定蛋白浓度，确保每个样品上样量一致。
-
原理：
（1）BCA：基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将Cu2+ 还原成Cu+，BCA鳌合Cu+ 作为显色剂，产生蓝紫色并在562nm有吸收峰，单价Cu+ 与蛋白质呈剂量相关性。
（2）Bradford法：在酸性分析试剂溶液中，染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的主要是阴离子形式的蓝色，其最大吸收峰（λ max）位置在590nm，形成的复合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系
PART THREE
样品准备
- Sample Preparation -
1
原理 >>
基于蛋白质在电场中的迁移速度与其分子大小的关系。
使用十二烷基硫酸钠（SDS）将蛋白质变性，使其失去原有的结构并带上负电荷。
SDS会与蛋白质分子结合，按质量比将其负电荷均一化，从而消除了蛋白质自身电荷差异的影响。
样品在聚丙烯酰胺凝胶中施加电场后，蛋白质根据其分子量大小迁移。
小分子量的蛋白质迁移速度较快，而大分子量的蛋白质迁移速度较慢。
2
SDS的作用 >>
SDS是一种阴离子去污剂，能结合蛋白质，使其完全线性化（破坏蛋白二级、三级结构）。
赋予统一的负电荷，掩盖蛋白本身的电荷差异，使迁移速度只受分子量影响。
3
聚丙烯酰胺凝胶的作用 >>
小分子蛋白穿过凝胶网孔更快，大分子蛋白则移动缓慢。
分离胶和浓缩胶的作用：
浓缩胶：将样品集中成窄条，方便进入分离胶。
分离胶：按分子量分离蛋白。
4
电场的作用 >>
蛋白被负电荷包裹，在电场中从负极（样品孔）向正极迁移。
电压过高可能导致胶过热，影响分离效果。
PART FOUR
转膜
- Blotting -
1
原理 >>
通过电场将已分离的蛋白质从凝胶转移到固体支持物上。
2
固体支持物选择 >>
PVDF膜：结合力强，适合灵敏度高的检测。
-
NC膜：性价比高，适合普通检测。
3
电转印的作用 >>
在电场作用下，蛋白从凝胶迁移到膜上。
优化条件：
小蛋白：高电压短时间。
大蛋白：低电压长时间。
4
甲醇的作用 >>
转膜缓冲液中含甲醇，可去除SDS，增加蛋白和膜之间的结合力。
PART FIVE
封闭
- Blocking -
1
原理 >>
通过使用封闭液来阻止非特异性抗体与膜上的非目标区域结合。
封闭液中的蛋白质会与膜上未被蛋白质样本或标记物占据的空位结合，从而封闭这些位点。
这样可以有效地减少背景信号，确保后续抗体仅与目标蛋白结合，增强信号的特异性和准确性。
2
常用封闭液 >>
脱脂奶粉：性价比高，适合大部分蛋白。
BSA：不含磷酸酪蛋白，适合检测磷酸化蛋白。
3
注意点 >>
奶粉封闭可能影响磷酸化蛋白检测。
封闭时间过短或未完全覆盖膜表面，会导致背景增加。
PART SIX
抗体孵育
- Antibody incubation -
1
原理 >>
基于抗原-抗体反应
在膜上转印蛋白后，通过孵育一抗（特异性抗体）与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。
孵育二抗（与一抗来源物种特异性的抗体）用于识别并结合一抗。二抗通常会结合标记物（如HRP或AP），通过显色或发光反应产生可视信号，帮助检测目标蛋白的存在与量。
这一过程的关键是二抗的多重结合特性，使得信号放大，从而提高检测的灵敏度。
2
一抗与二抗 >>
一抗：识别目标蛋白的特定抗原表位。
二抗：识别一抗的Fc片段，并与信号分子（如HRP或荧光）结合，放大信号。
3
优化条件 >>
抗体浓度过高：可能出现非特异性条带。
抗体浓度过低：目标蛋白信号弱。
PART SEVEN
检测和显影
- Detection -
1
原理 >>
二抗通常带有酶标记（如辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP）
显影过程中，加入底物，酶催化底物反应生成化学发光或颜色反应，产生的信号通过化学发光成像仪或显色法被捕捉并记录下来，从而实现蛋白质的检测和定量。
2
常用显影方法 >>
化学发光法（ECL）：HRP催化过氧化物分解，产生光信号。用显影仪捕捉化学发光图像。
荧光检测：利用荧光标记二抗，通过特定激发光源检测目标信号，适合多目标蛋白检测。
本期的WB小实验就到这里啦，下期更精彩！
