相较于传统3D技术方法，基于4D平台的蛋白质组学无论是在鉴定深度还是准确性上都能带来全面的提升。关于4D蛋白质组学，SBC小编在上期- 关于4D蛋白质组学，你想知道的那些事儿（一）为大家带来了关于4D-shot gun的Q&A，今天一起来看看对于4D-Label free又有哪些常见问题吧。
篇章二
4D-Label free：不需要对样品进行任何标记，每个样品可单独上机。利用DDA采集模式分析直接酶解后的蛋白肽段，获得蛋白质表达量变化情况，对蛋白进行定性定量分析。
Q1：为什么叫做Label free？
A：
提到Label free就不得不提到iTRAQ和TMT，iTRAQ和TMT分别是由Thermo Fisher和AB SCIEX研发的多肽体外标记定量技术，也是运用广泛的两种标记定量蛋白质组技术，具有相似的原理，两者主要区别在于：TMT最高可同时标记16组不同的生物样品，iTRAQ最高可同时标记8组不同的生物样品。
与上述两种多肽体外标记定量技术不同，Label free无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准，每个样品单独上机，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。其优势是无需依赖同位素标记，每例单独检测，因此实验设计灵活，适合临床大几十例、上百例样本的检测，同时也能看到样本中的“有还是无”的蛋白。缺点是对仪器的稳定性、实验人员的操作等可能产生系统误差的因素要求极高。
Q2：4D-Label free为什么更具优势？
A：
Label free每条肽段的丰度（量）与其在MS1中的峰面积或信号强度成正比；而不同样品的同一条肽段在LC上的保留时间（retention time, RT）是一致的，因此，可以通过对比MS图谱，再整合到相应蛋白，实现对蛋白质在不同样品中的相对表达水平的定量分析。由于常规DDA模式的Label free是基于topN的方法挑选母离子进行二级碎裂的，所以难免会损失一些丰度较低的信号。4D-Label free由于增加了第四个维度-离子淌度（mobility）作为额外的一个数据对齐参数显著减少了missing value，提高定量的准确性，因此定性和定量数据更稳定。
蛋白质磷酸化修饰调节着蛋白质的活性状态、定位、折叠以及蛋白质-蛋白质之间的交互作用等。许多至关重要的生命进程不仅由蛋白质的相对丰度控制，更重要的是被那些时空特异分布的翻译后修饰控制。因此，除了对基因组所编码的“裸”蛋白质组的研究以外，更需要对经过翻译后修饰的蛋白质及蛋白质组的调控过程进行深入的研究。由于磷酸化修饰会导致空间结构的微变化，常规3D分析不能完全区分，所以离子淌度（mobility）的引入使得4D-label free磷酸化鉴定更具优势。
Q3：4D-Label free有哪些应用研究案例？
A：
案例一：In-depth proteomics and natural peptidomics analyses reveal antibacterial peptides in human endometrial fluid
摘要：2020年，西班牙巴斯克地区大学的研究团队对子宫内膜液的蛋白质和天然肽进行了全面分析。使用高灵敏度的4D label free蛋白质组学技术分析了来自11个个体的样品的蛋白质含量。鉴定了4694种蛋白质以及3899种天然存在的肽。实验结果大大扩展了已知子宫内膜液蛋白质的目录，并提供了关于这种子宫内膜液中天然肽含量的大量新信息。
案例二：Quantitative Proteomic Analysis of Chikungunya Virus-Infected Aedes aegypti Reveals Proteome Modulations Indicative of Persistent Infection
摘要：蚊子传播的奇昆古尼亚病毒（CHIKV）对全世界热带国家的人类健康构成威胁。2020年美国密苏里大学的研究团队利用高灵敏度的4D label free蛋白质组学技术对感染和未感染的CHIKV的埃及伊蚊样本中鉴定出2647至3167种蛋白质，揭示了蚊子体内与CHIKV相互作用的生物途径和新蛋白质。总的来说，CHIKV感染引起蚊子蛋白质组的微小变化，表明载体和病毒之间高度适应，基本上以非致病关系共存。
案例三：In-depth proteomic analysis of Plasmodium berghei sporozoites using trapped ion mobility spectrometry with parallel accumulation-serial fragmentation
摘要：2021年法国索邦大学研究团队利用高灵敏度的4D label free蛋白质组学技术，结合三种不同的子孢子纯化方法，利用少量寄生虫鉴定伯氏疟原虫子孢子的蛋白质组。这项研究为伯氏疟原虫子孢子提供了一个参考蛋白质组，确定了一组跨物种表达的核心蛋白质，并说明了timsTOF PRO系统前所未有的灵敏度如何能够从有限的样本量进行深度蛋白质组分析。
案例四：Synergistically Bifunctional Paramagnetic Separation Enables Efficient Isolation of Urine Extracellular Vesicles and Downstream Phosphoproteomic Analysis
摘要：2021年，美国普渡大学研究团队基于新优化的分离方法——BiMBs方法，能够高效地从尿液中分离出细胞外囊泡，该方法具有低污染、高回收率以及分离时间短等优点。同时，结合高灵敏度的4D label free蛋白质组和4D label free磷酸化蛋白质组等新技术对前列腺癌患者和健康个体尿液外囊泡分析，找到一系列疾病相关的磷酸化蛋白质，表明其在临床研究中的巨大应用潜力。
案例五：Ultrafast and Reproducible Proteomics from Small Amounts of Heart Tissue Enabled by Azo and timsTOF Pro
摘要：2021年美国威斯康星大学麦迪逊分校的研究团队开发了一种超快速自下而上的4D label free蛋白质组学技术方法，该方法由Azo（偶氮,一种可光裂解的、与质谱兼容的表面活性剂，可有效溶解蛋白质并促进快速胰蛋白酶消化）与Bruker timsTOF Pro相结合，通过捕获离子迁移谱（TIMS）和肽的平行积累-串联片段化（PASEF）实现更深的蛋白质组覆盖。应用这种方法来分析复杂的人类心脏蛋白质组，从少至1毫克的人类心脏组织中鉴定了近4000个蛋白质组，具有高重现性。总的来说，作者预计这种由Azo和timsTOF Pro支持的超快速、稳健和可重复的自下而上方法将普遍适用，并大大加快大规模定量蛋白质组学研究的吞吐量。
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