写在前面的废话
我可能不适合做科研，因为我总是对一些“没有必要”的事斤斤计较~
刚开始接触二代测序时，是跟着Jimmy大神从RNA-seq开始入门的。那时候使用的比对工具是HISAT2。当时也没怎么细想为什么用这个工具，你说用那我就用吧，于是HISAT2就成了目前我最喜欢的比对工具
但是，随着需要处理不同的数据，我发现HISAT2不能满足我的要求了，我似乎需要考虑其他工具了，但我无从下手，不知道什么工具更适合我。于是一场不太考虑生物学意义，只思考工具特点的战斗便拉开了帷幕……
太长不看系列
- tophat调用bowtie，tophat2调用bowtie2
- HISAT2既能做RNA-seq也能做DNA-seq
- STAR是ENCODE官方推荐的RNA-seq比对工具
废话超多系列
虽然每次我都说这是废话超多系列，但我是真心想让你们认真看看这部分的内容。毕竟我能力有限，很难用几句简短的话把我想说的事情搞明白，除非我写文言文……
DNA-seq&RNA-seq
搜了搜各种帖子，发现大家在对比对工具进行比较时，都喜欢将其分为DNA比对工具（DNA-seq）和RNA比对工具（RNA-seq）。仔细思考你会发现，它们的区别仅在于是否会考虑跨外显子的比对（即：是否会将没有比对上的reads劈开，对劈开后的两部分再次比对）。
随着现在各种seq的出现，我们已经不能简单的根据是比对DNA还是RNA来判断工具的选择，而是要判断reads的比对是否需跨外显子。比如PRO-seq/GRO-seq，它们在建库时捕获的RNA，但是它们并不需要考虑跨外显子的比对。
鬼扯了这么多，简单总结一下各种类型的常用工具都有哪些：
- DNA-seq：bowtie；bowtie2；BWA
- RNA-seq：STAR；HISAT2；Tophat
以上都是我自己用过的，没有用过的对我来说都属于不常用的，因此不在这里比较
bowtie&bowtie2
bowtie出现在上古时期（就是很久远的意思了），那个时候测序行业的发展还不成熟，序列长度普遍在50bp以下，因此bowtie的出现就是为了满足长度在50bp以下的reads的比对。官方称其可以把短的DNA序列（35bp）快速的比对到人类基因组上。
而bowtie2的出现则弥补了bowtie的短板，bowtie2擅长比对50-100bp长的reads，长度甚至长达1000。它适合比对那些比较长的基因组，如哺乳动物基因组。
结论：bowtie和bowtie2，是两个不同类型的比对工具，bowtie2并非是bowtie的升级。尺有所长寸有所短，bowtie适合长度在50b长度以内的reads比对，而bowtie2适合50-100b，甚至更长的reads比对。但是这两个都属DNA-seq比对工具
Tophat和Tophat2
Tophat/Tophat2工具本身不能进行比对，它是通过调用bowtie/bowtie2进行比对的。划重点，bowtie2不是bowtie的升级版，但是Tophat2是Tophat2的升级版。因此Tophat只可以调用bowtie，而Tophat2不仅可以调用bowtie2（默认）还可以更改设置调用bowtie。
Tophat/Tophat2调用bowtie/bowtie2后，会首先使用bowtie/bowtie2对序列进行比对，对于那些没有比对上的，会考虑其跨外显子的可能性，将reads劈开重新比对。
如果你去bowtie/bowtie2/Tophat的官网仔细观察，你会发现，bowtie和bowtie2各自有自己的官网，有专属于自己的介绍。而Tohat就不同了，它只有一个，仅仅是在2012年4月9日Tophat发布了2.0.0版本，宣布支持bowtie2的比对。而我们通常也将支持bowtie2版本的Tophat称之为Tophat2。
此外，如果你够无聊，你在它们的主页上下扒拉扒拉，你会发现无论是bowtie还是bowtie2在2019年仍然是有更新的。但是Tophat到了2016年2月便停止了更新……这是为什么呢？请继续往下看
HISAT2
Tophat2的原作者们也不知道是出于什么考虑，不再更新Tophat2，转而开发了一个新的比对工具HISAT2，更是推荐人们使用HISAT2，声称其速度更快，内存占用率更小，准确率更高。
此外，HISAT2不仅支持RNA-seq的比对还支持DNA-seq比对，唯一需要做的就是加上一个参数--no-spliced-alignment。但是就目前来看，大部分人都是使用HISAT2做RNA-seq，没人使用它做DNA-seq
BWA
其实没有太多需要说的，是我最早知道的比对工具，属于DNA-seq比对工具。大部分搞全基因组或者全外的似乎都使用BWA作比对。当时本科时期有门课叫做计算生物学，当时学习BWT算法，还经常把算法名称和比对工具名称搞混。
值得一提的是这个工具是李恒开发的，如果你不知道李恒，你最起码也应该知道SAMtools工具，这东西也是李恒开发的。一个强的可怕的男人……
STAR
最早听到这个工具的名称是在研一时期，的确有点孤陋寡闻。当时以为是一个很小众的野鸡工具，后来发现身边蛮多人用这个工具的，于是就带着好奇心上网搜索它的资料。
不搜不知道，一搜吓一跳。啧啧啧，ENCODE皇家御用的RNA-seq比对工具，真香……
几款RNA-seq工具的比较
可能是因为RNA-seq分析比较大众，因此大部分的比对工具都是利用RNA-seq的效率进行比较。
《Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis》这篇文章可以称之为史上最全RNA-seq测评。对于RNA-seq的方方面面都进行了比较。因为太全面，反而有点杂乱，因此我只关注了我感兴趣的一些地方。
无论是HISAT2还是STAR，对于Tophat来说都有很大的优势，更何况Toph还不再继续更新，这就更给力我们不再使用它的理由。至于HISAT2，他的junction正确率最高，但是灵敏度相对较低。而STAR灵敏度更高，但是会有许多包含soft-clip的低质量比对。此外，STAR的unique mapping比例最高，它对于双端测序的reads，要么全部比对上，要么全部抛弃，不会像像TopHat和HISAT2一样只比对上某一个reads
最后这篇文章还给了一个它认为比较好的RN-seq组合方式：
- 比对用HISAT2
- reads count方法定量，采用FeatureCounts
- 差异表达选用DESeq2
前一阵的龙星课程针对RNA-seq给出了另一个组合方式：SATR+RSEM，其中STAR既可以比对也可以用于定量（count）
具体选用哪一个组合，看习惯，看眼缘，看心情……
