设计dCAPS标记及dCAPS标记酶切产物电泳实验
dCAPS标记的使用原理，如图A（参考NCBI）所示：
可以简单的理解为：在wild的片段中含有酶切位点，能被特异的切开，而mut的片段中没有酶切位点，不能被特异的切开；琼脂糖电泳时会把条带分开。
1.用dCAPS Finder 2.0 Output找酶切位点得到正向引物
已知变异位点在A09染色体6996108bp处。
在变异位点的前后各取25bp，物理位置为A09:6996083..6996133。
得到wild type sequence（加粗斜体的T为突变位置）:
TCAGTGCGTTCCAACGTTCTTGCCTTGTGACTTGCTCAACAAGTATTACCA
在26bp处将T突变为A，得到Mutant sequence:
TCAGTGCGTTCCAACGTTCTTGCCTAGTGACTTGCTCAACAAGTATTACCA
在dCAPS Finder 2.0 Output网站（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）粘贴wild type sequence和Mutant sequence后，设置引物错配数。如图1。
先设置为0，没有酶切位点引物；再设置为1，找到多个酶切位点引物。如图2。
最佳的酶切位点选择：6个碱基、有回文序列、常见的易获得的酶。
这里选择SpeI对应的引物，该引物为正向引物，记为:
>F
TCAGTGCGTTCCAACGTTCTTGACT
2.用Primer Premier 5设计反向引物
PCR扩增片段长度在150~200bp。以A09:6996083bp为起点取251bp的参考序列，得到：
>A09:6996083..6996333
TCAGTGCGTTCCAACGTTCTTGCCTTGTGACTTGCTCAACAAGTATTACCACGGCTTCTG
CAAACACTACCTCTGGCCCATCTTTCACTACCTCCTCCCCATGACCCAGGCCCAAGGATC
CCTCTTCGATCGATCCCACTGGAAGGCCTACACGAAGGTTAACAAGATCTTCGCTGACAA
GATCTCTGAAGTGCTCAACCCTGATGAGGATTACGTCTGGATTCACGATTACCACCTCAT
GATCTTGCCTA
在Primer Premier 5设计反向引物，如图3。
得到反向引物：
>R
AAGATCTTGTTAACCTTCGTGTAGG
3.检测引物特异性
BlastN检测引物特异性，OK。
到此，dCAPS标记就设计好了。
>F
TCAGTGCGTTCCAACGTTCTTGACT
>R
AAGATCTTGTTAACCTTCGTGTAGG
4.PCR扩增和酶切
5.高浓度、低电压的琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据酶切后要区分的片段长短选用合适的即可。
