空间转录组经典重磅

编辑：ANIMUS

校对：ANIMUS

编者按：2014年开始风靡全球的“冰桶挑战”，让ALS(肌萎缩侧索硬化症，俗称“渐冻人症”)为普通大众知晓。饱受渐冻症困扰的名人不少，包括只有一根手指能动却创造生命奇迹的科学家霍金，还有隐瞒身患渐冻症病情、顾不上被新冠感染的妻子，今年年初新冠疫情爆发之初就一直坚守在疫情“震中”的武汉金银潭医院院长张定宇。然而目前对渐冻症分子基础和发病机制尚不清楚，除了210万美元一针的对脊髓型肌萎缩1型的基因疗法外，尚无其它有效治疗方案。ALS作为一种罕见病，依然有待深入研究其分子病理学机制以挖掘新型治疗靶点。

爱丽慕斯学术团队专注于生命科学和医学前沿进展，探索心脑血管疾病和癌症的致病基因、发病机制和药物开发等，尤其是脑科学。作为本刊【Amazing brain】系列第三篇，这里解读应用空间转录组技术，研究肌萎缩侧索硬化（ALS）分子机制的文章，助力脑科学前沿进展共享。

肌萎缩性侧索硬化症（ALS）的瘫痪是由于运动神经元退化导致骨骼肌神经缺失所致。神经细胞和运动神经元之间的时空相互作用仍不清楚。2019年4月，纽约基因组中心神经退行性疾病基因组中心Hemali Phatnani，纽约Flatiron研究所计算生物学中心Richard Bonneau，和瑞典皇家理工学院Joakim Lundeberg合作在Science上发表题为“Spatiotemporal dynamics of molecular pathology in amyotrophic lateral sclerosis”的文章，使用空间转录组学（ST）获得疾病进程中小鼠脊髓的基因表达谱，以及ALS患者死后组织的基因表达数据，以研究ALS的潜在分子机制。作者确定了通路动力学，区分了早期小胶质细胞和星形胶质细胞群体之间的区域差异，并鉴定出了ALS小鼠模型和人类死后脊髓之间共有的几种转录通路中的异常。

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一、绘制小鼠ALS腰椎脊髓时间空间转录组图谱

研究者采集了正常（SOD1-WT）和ALS（SOD1-G93A ）4个时期（症状前、发病、症状期和终末期）的67只小鼠的1200个左右腰椎脊髓组织切片样本，通过空间转录组技术，获得了76000个空间基因表达测量值（SGEMs）。随后在7例人腰大肌或球囊发病的散发性ALS患者尸检腰椎和颈脊髓组织80个切片中进行ST来验证，获得了60000个SGEMs。

随后作者开发了数学模型和算法将每个SGEM注释（映射）到脊髓11个解剖注释区域（anatomical annotation region，AAR）（图1A）。为准确评估不同阶段、不同解剖区域、不同细胞类型间的基因差异表达，作者构建了新算法——层次生成概率模型（hierarchical generative probabilistic model），解决单细胞和空间转录组中由于采样不足和偏差造成数据缺失这一重要问题。最终在小鼠和人样本中分别检测到11138和9624个基因的空间表达。此外，对全部小鼠SGEM数据集进行PCA分析发现，大部分方差来自空间位置、疾病状态和基因型，而不是批量效应。

本分析揭示了几个已知ALS基因（如Matr3、Kif5a和Pfn1）表达的改变，同时揭示了ALS进展相关基因的时空表达模式，免疫荧光实验（IF）也成功验证了对应蛋白的空间表达（图1C）。此外，研究结果表明ALS中小胶质细胞功能障碍发生在症状开始之前，早于星形胶质细胞功能障碍，并且是接近运动神经元的。

图1 小鼠脊髓内基因表达的时空表达

二、出现症状前TREM2和TYROBP介导的信号失调

ST结果表明，ALS与运动神经元附近的小胶质细胞和星形胶质细胞功能障碍相关，因此，作者重点研究了神经退行性疾病模型中Trem2介导的机制。Trem2和Tyrobp与膜类或脂蛋白复合物接触时会形成一种受体复合物，可触发吞噬作用或调节细胞因子信号。ST数据表明，小鼠ALS模型中，Trem2介导的机制具有时空顺序。Tyrobp表达量上调早于症状出现前，早于Trem2在腹角和腹白质中表达。此外，Lpl和B2m于症状前特异性地在腹角中表达量上调，而Apoe和Cx3cr1则没有上调。这些晚期基因广泛地在出现症状小鼠脊髓中表达量上调。同时发现Apoe的表达由Trem2信号驱动，且Apoe本身也是Trem2的配体。因此，Apoe和trem2两者是在一个自我调控的环路中发挥作用，可触发和维持小胶质细胞的吞噬表型。

总而言之， Trem2和Tyrobp介导的信号转导是小胶质细胞疾病相关变化的早期步骤，揭示了这些变化的时空表达特点。

图2 症状前Trem2和Tyrobp介导的信号紊乱

Trem2调控的自噬和内溶酶体系统基因的紊乱导致ALS。ST分析和IF成像显示，参与自噬和内溶酶体系统的基因在ALS小鼠模型的脊髓中表达处于紊乱状态（图3）。抑制自噬（对胆碱能细胞中Atg7进行条件性敲除），可导致小鼠更早出现ALS症状，其存活率延长，这也部分回补了ALS小鼠的反应性神经胶质增生。

为研究自噬功能障碍与ALS中的胶质细胞增生和运动神经元丧失之间的关系，对Atg7 cKO小鼠进行同样ST实验，结果表明运动神经元，特别是在AARs远端肌动神经元中的自噬作用消失时，Gfap和Aif1的表达以及Trem2微胶质激活轴的活性大大降低。

图3 症状前Trem2和Tyrobp介导的信号紊乱。

A，在SOD1-G93A中，溶酶体markers在多种细胞类型中处于紊乱和异常分布。B，出生后70 (P70)和100（P100）天时Aif1和Gfap的空间mRNA表达

三、ALS疾病进展过程中基因表达的时空动态

为发现疾病相关的不同细胞类型之间基因表达和相互作用的变化，对ST数据进行基因共表达分析，鉴定了31个主要共表达模块B(图4A)，它们具有不同的时空和通路活性，其中一个子集在Atg7cKO中受到影响（图4B）。并结合已发表的scRNA-seq数据，许多模块由特定细胞类型中优先表达的基因组成。根据基因在不同细胞类型中的特异性表达，对每个模块中的基因进行分组，得到亚模块（图4C）。在特定细胞类型中富集的亚模块，依赖于他们的父模块，表现出不同的时空表达模式，这些差异代表了该细胞类型中功能不同的亚群。

总而言之，ST结果确定了区域星形细胞群的基因表达特征，它们表现出明显的、与疾病相关的时空动态，并在不同程度上依赖于胆碱能自噬。同时，本方法可鉴定反映疾病主要的多种细胞类型间的协同调控，并展示与这些生物学过程相关的不同细胞类型中的基因表达过程。其中模块8所包含的通路数据揭示了完整组织中神经胶质早期激活过程中细胞内和细胞间的信号转导，及ALS小鼠模型中维持和扩展反应性表型的机制。

此外，模块1中小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的基因表达过程的时空相关性揭示了晚期ALS小鼠模型轴突病理相关的胶质行为中多种信号机制的协同作用。

图4 ALS疾病进展过程中基因表达的时空动态

四、ALS患者死后脊髓组织中鞘磷脂信号通路

为验证小鼠模型和人ALS数据的一致性，作者对4例延髓出现症状的ALS患者和3例下肢出现症状的ALS患者的颈椎和腰椎组织进行ST分析。它们表现出预期的区域基因表达模式，与上述小鼠数据一致。本研究也发现ALS病理的严重程度与症状部位的邻近程度有关，与前人研究一致。人ST数据显示，腹角基因表达变化与邻近程度相关。

例如，编码乙酰胆碱酯酶的基因（ACHE），其活性与ALS中的神经肌肉缺陷有关，并在病灶处脊髓节段邻近处表达量降低（图5A&B）。对人ST数据也进行无偏共表达分析，产生了28个共表达模块，部分在人和小鼠中都存在。人的共表达结果表现出AAR特征模式，部分模式沿头尾轴（rostrocaudal axis）变化（图4C），或在白质和灰质之间有差异，或接近病灶。此外，人模块3在病灶附近脊髓节段减弱，且在后白质和腹角的衰减最显著。KEGG分析表明，人模块3富集到多个通路，包括鞘脂类、逆行内源性大麻素和wnt信号（图5C）。这与疾病相关的人和小鼠子模块也被富集到鞘磷脂信号通路一致，表明其在ALS病理学中的重要性。

事实上，在ALS患者脊髓和SOD1ALS小鼠模型中都有研究报道其糖脂水平及代谢的变化。有研究推荐神经鞘磷脂信号转导物质作为一种潜在的治疗方法。

本研究详细描述了多种细胞类型、脊髓区域和疾病进程中鞘磷脂信号的动态变化，为开发治疗策略提供了指导。

图5 PIGs基因表达的相关性变化

五、总结

本研究利用空间转录组（ST）研究了ALS小鼠疾病进程（症状前、发病、症状期和终末期）中转录组学水平的基因时空表达谱，揭示了ALS的分子病理机制，包括疾病早期小胶质细胞Trem2和Tyrobp介导的信号转导等；并在临床样本中进行了验证，通过基因共表达分析，发现鞘磷脂信号可作为ALS的治疗靶点。

爱丽慕斯学术团队推出【Amazing brain】系列，解读脑科学相关重磅文章。

下期预告：小编解析心脏发育的空间转录组Cell文章。

参考文献

1. Spatiotemporal dynamics of molecular pathology in amyotrophic lateral sclerosis.[J]. Science (New York, N.Y.), 2019, 364(6435):89-93.