1.目的序列载体构建;
2.通过PCR方式,在目的序列一端连上T7启动子;
3.体外转录目的RNA并标记生物素 ;
4.用带生物素标记的RNA探针去拉与该RNA互作蛋白,并通过链霉亲和素磁珠把RNA-蛋白复合体富集下来。该pull down过程有两种方式:
a.RNA探针与蛋白在胞外孵浴结合,然后用磁珠富集;
b.将RNA探针转染细胞,探针与蛋白在胞内结合,然后裂解细胞并通过磁珠富集。
5.RNA pull down 产物银染,直观检测pull down产物量,及差异条带;
6.pull down 产物检测:
a.鉴定目的RNA与哪些蛋白结合:质谱检测;
b.验证RNA与某个具体的蛋白是否结合:WB检测;
RNA pull down 产物电泳图