手术前的新辅助化疗 (NAC) 和免疫检查点治疗 (ICT) 彻底改变了膀胱癌的管理。如何在临床上找到可以最大获益的患者群，仍然面临缺乏有效临床反应预测生物指标的挑战。

来自美国西达赛奈医学中心的研究人员将单细胞核测序（snRNA-seq）与空间转录（10x Visium）和单细胞空间原位超多色荧光检测（CODEX）分析相结合分析人类膀胱癌，发现根据肿瘤CDH12的丰富程度对患者进行分层可以比目前确定的膀胱癌亚型提供更好的预后预测，为设计生物标志物指导的临床试验提供了新思路。研究成果“An N-Cadherin 2 expressing epithelial cell subpopulation predicts response to surgery, chemotherapy and immunotherapy in bladder cancer”发表在期刊《Nature Communications》。

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01-单细胞核转录组（snRNA-seq）分析

研究人员首先对肌层浸润性膀胱癌（MIBC）的肿瘤进行snRNA-seq分析，根据各种细胞群体的标志性基因，发现肿瘤细胞占比约为90%，免疫细胞占比约为5%，成纤维细胞占比约为3%，内皮细胞占比约2%。进一步对各个群体的细胞基因进行分析，发现了两群“冷”肿瘤（即缺乏来自免疫浸润的MIBC的基因特征的群体）KRT13和UPK群体。为了更好的识别表皮细胞，随后进行了功能富集分析，发现CDH12表达细胞粘附和细胞发育相关的基因通路有关，尤其发现了ALDH1A1膀胱干细胞标志，推测可能具有干细胞特性，然而“冷”肿瘤群体有分化调控相关基因有关，如PPARG和GATA3基因。

图1 snRNA-seq 发现CDH12+肿瘤细胞群

为了深入了解新发现的上皮细胞群体的生物学起源和分化途径，研究人员再对4个正常的膀胱组织进行snRNA-seq分析，发现了基底，间质细胞和伞型细胞群体，而之前认为高表达基因均在CDH12群体中表达更低，比如TERT和SOX4。通过速率分析发现群体分化有两种途径，一种是通过CDH12群体，另一种是跳过CDH12群体，最终分化为间质群体和伞状细胞群体，确定CDH12群体是一个关键分化节点。此外，再次采用受配体算法对snRNA-seq进行分析，发现CDH12表皮细胞和T细胞通过 ITGA1相互作用，且与CD8 T细胞有很强的PDL2-PD1和CTLA-4免疫抑制作用。

图2 CDH12+肿瘤群体类似于早期未分化尿路上皮细胞的特征，与较差的临床预后相关

02-CDH12细胞与CD8 T细胞共同定位

为了验证可能的CDH12细胞群体和T细胞的相互作用，研究人员通过10x Visium平台分析肿瘤的空间分布，发现富含CDH12特征的区域也富含CD8T与衰竭的关键标志基因，而富含KRT13/UPK特征的区域没有表现出T细胞基因的富集。不仅得到了和单细胞核的相关基因关系，还发现了在Visium玻片高表达CDH12标签的区域也能发现CD8 T细胞的耗竭相关基因。

图3  CDH12细胞与CD8 T细胞共同定位

03-细胞社区（CNs）分析CDH12上皮细胞与T细胞互作机制

为了进一步在单细胞空间水平上确认CDH12亚群和CD8 T细胞群的位置关系，研究人员使用CODEX技术对肿瘤组织进行35-plex的抗体组合原位分析，共定位出约36万的上皮细胞，14万的免疫细胞和9万的基质细胞。观察到CDH12上皮细胞比KRT13上皮细胞更接近CD8T细胞，表明这两个不同的细胞群有不同的空间分布。

图4  CODEX的抗体panel

为进一步了解CDH12 +上皮细胞和KRT13 +上皮细胞空间分布的差异，研究人员进行了细胞社区（Cellular Niches, CNs）分析，使用不同细胞社区（CN）识别在肿瘤中常见的不同肿瘤细胞和免疫细胞组合形成的空间表型。在CODEX数据中，共鉴定出20个典型CN，包括免疫细胞富集的细胞社区(如 TLS富集)、间质细胞富集的CN、上皮细胞富集的CN。CN分析进一步证实了CDH12+ 上皮细胞和KRT13 +上皮细胞在肿瘤微环境中空间分布的差异，CDH12 细胞位于多个空间表型不同的免疫渗透的CN中，而 KRT13 细胞仅限于类似于免疫“沙漠”表型的CN中。且与非CDH12表达的区域相比，CDH12高富集的细胞节点区域也发现有很高的CD49a和PD-1等蛋白，结合阿替利珠单抗治疗结果，也解释了那些在治疗前有高CDH12打分的患者有更好的治疗效果和更高的存活几率。

图5 CDH12肿瘤细胞优先与表达CD49a、PD-1和LAG3的t细胞共定位

04-总结

研究人员通过snRNA-seq，10x Visium以及CODEX技术，从蛋白表达水平验证转录组数据信息，支持独立的细胞深度分型分析、深度空间表型分析，通过CN分析解析肿瘤中不同免疫细胞和肿瘤细胞的空间关系和分子作用机制。完成了膀胱癌的治疗预测分析以及可能的机制分析及治疗原理，为未来的治疗和诊断提供了理论依据。

【参考文献】Gouin KH 3rd, Ing N, Plummer JT, et al. An N-Cadherin 2 expressing epithelial cell subpopulation predicts response to surgery, chemotherapy and immunotherapy in bladder cancer. Nat Commun. 2021.