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研究背景
硫化氢(H2S)是一种气体信号分子，在生命系统中介导血管平滑肌松弛、神经递质调节、氧化还原状态调节等多种生理和病理过程。越来越多的证据表明，H2S水平的失调与阿尔茨海默病、糖尿病和心血管疾病有关。因此，人们开发了许多硫化氢前体药物来治疗这些疾病。但是目前还没有有效的方法来评估H2S前体药物的释放率。因此，开发H2S前药释放实时评价技术对前药开发具有重要意义。
为了解决这个问题，科学家设计了许多用于特异性识别硫化氢的荧光探针，包括叠氮或亚硝基还原反应、亲核加成反应、铜离子沉淀和硫解反应。然而，已报道的大多数荧光探针因为对硫化氢选择性差、响应时间长、斯托克斯位移小，检测效果并不好。
以荧光素作为荧光团的近红外荧光染料NFL-OH因为具有独特的共轭骨架结构，光学稳定性好、斯托克斯位移大、荧光量子产率高、合成路线简单、较好的结构可修饰性以及可调节的吸收和发射波长，在荧光探针的结构设计中被广泛应用。
H2S并不是直接参与生理过程，通常在临床上使用硫化氢前体药物，因此检测前体药物的硫化氢释放效率具有重要意义。并且根据文献报道，ADT-OH可以作为H2S的供体在细胞内裂解并释放H2S。
本文的研究
图 1
如图1，本文章以硫化氢的前体药物ADT-OH为研究对象。NFL-OH与1-溴-3，5-二硝基苯形成醚键，得到探针(NFL-DNBr)。新化合物含有两个硝基，PET效应导致NFL-OH的荧光猝灭. 当NFL-DNBr遇到H2S时，醚键被H2S攻击并断裂，然后回到NFL-OH的状态，荧光恢复。
在体外实验中，在680 nm激发下，随着H2S浓度的增加，探针NFL-DNBr表现出良好的荧光增强效应。在细胞实验中，该探针在680 nm激发下对H2S前药有很强的荧光信号。该探针的细胞毒性较低。此外，该探针对H2S的最低检测限为23 nm。在体内成像实验中，裸鼠腹腔注射后60 min检测到最大荧光强度。因此，该探针非常适合于H2S前体药物的体内检测，并具有良好的荧光成像能力。
(1) 细胞中硫化氢的检测
图 2
游离NFL-DNBr探针(10 μM)培养时，在近红外通道几乎看不到荧光。当用探针NFL-DNBr(10 μM)和NaHS培养细胞时，在近红外通道可以看到明显的荧光信号(图 2A)。该结果表明，该探针能够在活细胞中检测到外源H2S。
(2) 硫化氢前体药物在活细胞的释放效率评价
前药的作用机理如图2B所示。然后，用前药预处理细胞30 min，再与探针NFL-DNBr(10 μM)孵育0、1、2、3h进行共聚焦成像。近红外通道显示，荧光信号的强度随着孵育时间的增加而增加(图 2C)。这些结果表明，该探针可以实时监测细胞内药物H2S的释放。
(3) 硫化氢前体药物在活体内的释放效率评价
图 3
后来，作者用裸鼠来评估探针在体内监测前药的能力。在两组裸鼠中，一组使用NFL-DNBr和生理盐水腹腔注射，另一组使用NFL-DNBr和前药腹腔注射。注射NFL-DNBr和生理盐水后，小鼠的荧光随时间没有明显变化，而注射NFL-DNBr和前药的小鼠则出现明显的荧光变化(图3)。提示该探针可用于实时监测硫化氢前体药物的体内释放效率。
文献原文：Yang, S.; Zhou, F.; Yao, X.; Liu, W.; Zhu, W.; Qian, X.; Liu, Y., A novel near-infrared fluorescent probe to in vivo evaluate the release efficiency of H2S prodrug.Sensors and Actuators B: Chemical 2021,339.
DOI:10.1016/j.snb.2021.129881
