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摘要
质谱流式组织成像（Imaging mass cytometry, IMC）能够对细胞类型和状态进行高维单细胞分析。在大规模细胞术中，稀土金属被用作抗体的报告者。使用质谱细胞仪分析金属丰度可以测定单个细胞中的标志物表达。质谱细胞术以前只应用于细胞悬浮液。为了获得空间信息，作者将免疫组化和免疫细胞化学方法与高分辨率激光消融耦合到CyTOF质谱。这种方法能够以亚细胞分辨率同时成像32种蛋白质和蛋白质修饰;随着其他同位素的可用性，将有可能测量100多种标记物。作者将成像质量细胞术应用于人类乳腺癌样本，从而可以描绘细胞亚群和细胞间相互作用，并突出肿瘤的异质性。质谱细胞计数成像是对现有成像方法的补充。它将使组织异质性和功能的基础研究成为可能，并支持医学向个体化分子靶向诊断和治疗的过渡。
成像质谱细胞仪
作者在这里介绍一种成像技术，该技术扩展了基于CyTOF的质谱细胞术的多重分析功能，以进行空间分辨测量。他们开发了一个工作流程（图1），将质谱细胞术、ICC和IHC分析与高分辨率激光消融系统相结合，以便在1μm的细胞分辨率下分析贴壁细胞和组织切片。在第一步中，使用常规ICC和IHC方案（制备细胞样品或组织切片以进行抗体标记。选择抗体来靶向与乳腺癌相关的蛋白质和蛋白质修饰。在染色之前，抗体被标记有一种独特的稀土金属同位素，其原子质量是确定的。目前，有32种稀土金属同位素可以作为报告者。空气干燥后，将样品放置在最近开发的激光消融室中，以最大限度地减少气溶胶扩散，以进行高分辨率，高通量和高灵敏度的分析。然后将组织逐点逐行激光刻蚀，然后通过混合的氩气和氦气流将刻蚀材料输送到CyTOF质量细胞仪。
根据本研究中提供的数据集确定，假设泊松统计，在20 Hz下单个激光射出的信号是完全分离的（图2），检测限约为6个离子计数（对应于∼500个分子）。经过数据预处理后，使用每个激光拍摄的坐标绘制32个瞬态单同位素信号，并通过叠加所有分析的测量通道生成样品的高维图像。接下来，使用分水岭算法对单细胞特征进行计算分割，并提取单细胞标志物表达数据。这些单细胞数据用于所有下游数据分析，并研究来自20名乳腺癌患者的21个肿瘤和正常样本中的细胞亚群。
方法的有效性
为了评估IMC对IHC的有效性，作者首先使用FFPE乳腺癌样品进行实验，以确保抗体的金属标记不会干扰其靶标特异性。使用IFM分析比较了来自相同类型肿瘤的210号和37号组织的连续切片在未标记和金属标记抗体的状态（图2a、图supp 2）。可以观察到金属标记后，抗体特异性没有明显变化。定量分析表明，未标记抗体和金属标记抗体之间每个标记物的平均单细胞荧光强度的差异虽然显著，但很小：histone H3为-7%（H3;P < 4.7 × 10−10），epidermal growth factor receptor 2 为27%（HER2;P < 1.0 × 10−12），cytokeratin 8/18为27%（P <3.7×10−3）， E-cadherin 为7% （P < 2.5 × 10−11）， −2% 为 vimentin （P < 4.2 × 10−2），cytokeratin 7为22%（P <5.8×10−36) (supp 3）。这些差异完全在实验过程中以及相似但不相同的连续组织切片中观察到的可变性范围内。单细胞标记物荧光强度分布的一致性进一步证实了未标记抗体和金属标记抗体之间的相似性（图supp 3）。
然后，作者研究了由IMC生成的图像是否再现了染色模式和由IFM标记的细胞百分比。发现在一系列组织切片上，IFM和IMC中表达分析标记物的肿瘤细胞百分比相似(图3b): H3分别为100%和100%;HER2为75%和79%;cytokeratin 8/18分别为63%和66%(图6)。
作者还评估了单重IHC，双重IFM和32位IMC分析是否产生一致的结果。质谱流式组织成像在使用相同的抗体（CK 8/18和H3）或使用不同的抗体克隆针对同一腔内 luminal HER2+型肿瘤（编号210）中的相同靶标（HER2和PR）进行实验时，染色模式与单级IHC相似。对于IHC和质谱流式组织成像，>90%的上皮细胞表达这些标记物（图supp 6）。此外，32-plex cyTOF与双重IFM分析中的细胞空间分布和肿瘤细胞的百分比也显示出相似性(图2b和图supp 4)。总之，这些结果表明多路复用并没有导致抗体行为的显著变化。
最后，作者还确定IMC是否可用于评估ICC方案中的贴壁细胞系。
这些结果表明，质谱流式组织成像能够以亚细胞分辨率同时进行高度多路复用的组织和贴壁细胞的成像。未标记抗体和金属标记抗体之间的特异性和性能没有明显变化，单重IHC，双重IFM和IMC的多重分析中使用的抗体之间也没有明显的变化。
乳腺癌肿瘤异质性分析
在乳腺癌中，根据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人类表皮生长因子受体（HER2）的表达可将乳腺癌区分成为4类：HR+ HER2-，HR+ HER2+，HER2+，TNBC。作者使用IMC技术来描述细胞亚群表型，以及探索亚型内、亚型间的异质性。在组织微阵列（TMA）上分析了21个FFPE样本，之前病理学家将其分为主要乳腺癌亚型或正常。并使用spanning-tree progression analysis of density-normalized events (SPADE) 分析确定了细胞亚群和细胞转变（图5a）。
结束语（自己写的）
近年来，单细胞分析成为了一大热门，从单细胞转录组到单细胞蛋白，再到单细胞代谢。多组学单细胞已经成为趋势。随着时间的推移，科研工作者会向着空间单细胞组学去努力，从2维到3维。目前，市面常见的空间转录组还没到达单细胞水平，单细胞蛋白的可检测指标相较于转录组来说信息还是很少，空间代谢也在萌芽中。但在科研工作者的努力下，未来必然会被突破。
[参考文献]
Giesen C, Wang H A O, Schapiro D, et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry[J]. Nature methods, 2014, 11(4): 417-422.
