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研究背景

生物硫醇在人体内主要以低分子硫醇或蛋白质硫醇的形式存在，主要包括半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、同型半胱氨酸(Hcy)和蛋白质中的半胱氨酸残基。当细胞内或外部环境发生变化时可以转化为不同的氧化中间体，在各种生理过程中发挥着重要作用，如维持氧化还原平衡、蛋白质合成和解毒。

许多研究表明，这些硫醇的内源浓度变化与相应的酶和蛋白质的功能状态有关。它们的异常水平与疾病有关。胱硫醚b-合成酶(CBS)催化同型半胱氨酸(Hcy)与丝氨酸缩合生成胱硫氨酸(Cystathionine)，丝氨酸再被胱硫氨酸葡萄糖裂解酶(CSE)水解为半胱氨酸(Cys)。

半胱氨酸是构成谷胱甘肽(GSH)的天然成分之一。它是人体的一种非必需氨基酸，主要存在于蛋白质中。半胱氨酸水平异常会导致许多疾病，如儿童生长迟缓、肝脏损伤、缺血性中风、头发色素沉着、水肿、嗜睡、皮肤损伤和虚弱、肌肉和脂肪减少等。由于生物硫醇具有相似的结构和对环境的敏感性，开发新的工具对其进行区分和动态检测仍然是一个巨大的挑战。

荧光成像技术以其非侵入性、高特异性、可视化、实时动态监测等优点逐渐进入研究人员的视野。近年来，许多荧光探针被广泛应用于生物活性物质的成像，以揭示细胞内或体内的生命现象。选择了2，4-二硝基苯磺酰基、丙烯酰基、2，4-硝基苯并二恶唑(NBD)等一系列受体作为探针设计的识别基团，并对它们之间的差异进行了总结和比较(Fig 1A)。

尽管目前已经开发了很多用于半胱氨酸检测的荧光探针，但现有的荧光探针都存在这样或那样的不足(生物相容性、选择性和灵敏度)，这极大地限制了它们在实际应用过程中的应用。而且，大多数研究都集中在新型探针的设计上，很少有研究考虑将其用于实时监测应激反应半胱氨酸的波动，以揭示其在生命系统中的作用。因此，需要开发一种新的成像策略来为应激反应半胱氨酸的波动提供视觉证据。

本文的工作

图 1 

考虑到这些因素，作者设计并合成一种半胱氨酸选择性荧光探针来监测半胱氨酸的波动，并为应激响应生命系统中的半胱氨酸波动。作者开发了一种用于生物硫醇传感的化学共价策略，使用的是含有甲基亚砜部分的化合物和蛋白质硫醇标记。

因此，作者利用近红外谷胱甘肽荧光探针成功地评价了线粒体谷胱甘肽在脑缺血/再灌注损伤中的保护作用。在这项工作中，作者选择化合物2(图 1B)作为荧光团，因为在作者以前的工作中发现它的骨架适合于比率荧光探针设计。2，4-二硝基苯磺酰被选为识别基团是因为它的两个特性：一是它是一个强缺电子基团，能有效猝灭荧光团的荧光；另一种是可以用较强的亲核剂取代，这可能为根据生物硫醇的电离常数(PKA，Cys，8.3；GSH，8.8；Hcy，10.0)进行鉴别检测提供了潜在的可能性。

作者成功地设计并合成了荧光探针1来检测半胱氨酸，其灵敏度和选择性高于谷胱甘肽和同型半胱氨酸。它可用于活体细胞内源性和外源性半胱氨酸的成像。更重要的是，作者还成功地监测了半胱氨酸的波动，并通过Hg2+和H2O2刺激证实了细胞内半胱氨酸水平与氧化应激之间的关系(图 1B)。

图 2

为了评价该探针在活细胞中监测半胱氨酸(Cys)的能力，作者将其应用于Hep G2细胞内源性半胱氨酸(Cys)的成像。用探针孵育细胞，分别观察5、15、20、30min。如图2所示，随着时间的推移，绿色荧光信号逐渐出现并变强。结果表明，该探针可用于活体细胞内源性半胱氨酸的检测。

图 3

用半胱氨酸(Cys)预处理30 min，将外源性Cys导入活细胞，然后用探针进一步孵育30 min。如图3 f和g所示，由于外源添加提高了半胱氨酸水平，绿色荧光信号明显变强。为了减少半胱氨酸的含量，选用巯基清除剂N-乙基马来酰亚胺(NEM)对半胱氨酸进行封闭。Hep

G2细胞与NEM孵育30 min，再与探针孵育30 min。共聚焦成像结果显示，NEM治疗后绿色荧光明显减弱，几乎消失(图 3h)。荧光可以通过随后外源添加半胱氨酸来恢复(图 3i)。这些结果有力地证实了该探针是监测Cys波动的实用工具。

在生命系统中，半胱氨酸以独立的个体或蛋白质半胱氨酸(包括RSH和RSSR)的形式存在。在氧化条件下，RSH可以被氧化并转化为二硫化物。为了了解蛋白质半胱氨酸的变化，作者用NEM封闭硫醇，然后用三(2-羧乙基)膦(TCEP，一种生物体系中常用的二硫键裂解还原剂，1 mM)处理30 min。细胞与探针孵育后，在通道中观察到绿色荧光(图 3j)。在这一部分，作者成功地利用NEM和TCEP进行了调节半胱氨酸水平的成像实验，以评估探针在监测半胱氨酸波动方面的实际应用。

图 4

重金属离子，如Hg2+和Cd2+.，因其对环境安全和公众健康的危害而引起人们的广泛关注。这些金属离子很容易通过食物链积聚在体内，最终导致多项严重疾病。然而，很少有研究提供重金属离子如何影响内源性生物分子波动的可视证据。考虑到Hg2+对硫的高度亲和力，作者探讨了Hg2+与半胱氨酸水平的关系。

如图4A所示，低浓度的Hg2+没有引起明显的荧光变化(小于20 mM)。当Hg2+浓度达到50

mM时，荧光被显著猝灭，表明半胱氨酸水平受Hg2+的调节。结果表明，Hg2+与半胱氨酸（包括蛋白半胱氨酸残基）的配位直接降低了半胱氨酸的浓度；二是Hg2+配位引起的氧化应激爆发降低了系统的抗氧化能力，从而进一步降低了半胱氨酸的浓度。

为了阐明Hg2+对半胱氨酸水平的调控，作者进行了不同浓度的H2O2预处理半胱氨酸的成像实验。如图4B所示，当细胞与100

mM H2O2孵育时，荧光略有增强。在生物抗氧化系统的调节能力范围内，细胞会促进半胱氨酸的生物合成以对抗氧化应激。当H2O2浓度增加(大于300 mM)并超过自我调节时，半胱氨酸将被消耗，导致荧光衰减。这些结果表明，该探针可用于监测Hg2+诱导的活细胞半胱氨酸波动，首次为Hg2+调控半胱氨酸波动提供了直观证据，为揭示重金属离子中毒的机制开辟了一条新的途径。

文献原文：Yang, Y.; Zhang, L.; Zhang, X.; Liu, S.; Wang, Y.; Zhang, L.; Ma, Z.; You, H.; Chen, L., A cysteine-selective fluorescent probe for monitoring stress response cysteine fluctuations. Chem Commun (Camb) 2021.

DOI：10.1039/D1CC01110C