什么是甲基化芯片？一文了解 MethylationEPIC 850K 甲基化芯片 

简而言之，是基于亚硫酸盐处理后的DNA序列杂交的信号探测。亚硫酸盐是甲基化探测的：金标准“，不管是芯片或者甲基化测序，都要先对DNA样品进行亚硫酸盐处理。 

Illumina甲基化芯片的发展主要经历了27K、450K以及EPIC(即850K）（27K，450K，850K指能测到的CpG甲基化位点），目前积累的数据主要是450K芯片的。

甲基化相关名词

CpG 岛:Defned as regions 500 bp, 55% GC and expected/observed CpG ratio of 0.65. 40% of gene promoters contain islands.

CpG shelves:~4Kb from islands.

CpG shores:~2Kb from islands, 75% of tissuespecifc differentially methylated regions found in shores. Methylation in shores shows higher correlation with gene expression than CpG islands.

Differentially methylated regions (DMR):Cell-, tissue-, and condition- specifc differences in methylation.

Enhancer（增强子）：DNA短片段，可激活转录

Hypermethylation:Most cytosines are methylated.Hypomethylation:Most cytosines do not have 5-mC. Euchromatin and active gene promoters are hypomethylated.

Beta value:通常的甲基化衡量方法被称为“Beta”值; 等于甲基化百分比，并定义为“Meth”除以“Meth + Unmeth”。（值在0到1之间）

CGI:CpG island 即甲基化岛

pd文件：探针注释文件（3种方法获取：从UCSC Xena下载，从GEO下载对应平台的注释文件，从ChAMP包中提取）

betaM:甲基化信号值表达矩阵，也可类似表达矩阵下载原始数据IDAT文件后处理

甲基化芯片的计算（得到甲基化信号值矩阵）

那么当矩阵不合理时，不直接下载甲基化信号值矩阵时，可如何从原始.IDAT文件得到？

1.illumina genomeStudio 软件（局限小样本）直接自动将原始数据IDAT转换成甲基化信号文件,β=M/(M+U+100) ，然后使用P值对数据进行质量过滤，P值大于0.001的β值被认为低于最小强度，阈值显示为“NA”，因为我用的是R和Rstudio，所以继续往看下👇

2.minfi包有getM和getBeta函数来分别计算M-values和Beta-values     

包的作者认为：

M-values具有更好的统计特性，更适合用于进行下游的统计分析（差异分析等）： Beta-values更容易解释，更能说明生物学上的意义

minfi包的一个函数read.450k.exp也可以直接读.IDAT文件（minfi不能读其压缩文件）

公式计算：平均值β=信号B/（信号A+信号B+100)看情况，可能是加0.001，主要是因为Beta值在0到1 之间，加一点防止其为0。

通过计算甲基化（信号A，对应M）和未甲基化（信号B，对应U）等位基因之间的强度比来确定DNA甲基化水平（β值）,荧光信号的比率β=Max( M,O)/[Max（M.0)+Max(U,0)+100)一般来说：β值的意义

大于或等于0.6的被认为是甲基化； 等于或小于0.2的被认为是完全未甲基化的；  β值在0.2到0.6间被认为是部分甲基化

3.CHAMP包下载

甲基化芯片分析需要厂商提供芯片注释信息（注释文件）

主要的两种芯片450k和EPIC（即850k)，两种探针都是以cg开头的数字编号，芯片注释也就是提取这些探针的所对应的信息，如探针序列的CpG位置信息，对应的基因信息，染色体上的位置信息。很多包在安装的时候都会自动下载这些注释信息，并包装在一起，如果我们想要✨自己注释这些探针，就要考虑如何获取独立的注释信息。而所需要注释数据的，大部分都来自于两个数据库，GEO和TCGA。

👉三种提取注释信息的方法：从UCSC Xena(TCGA)下载,从GEO下载对应平台的注释文件, 从ChAMP包中提取 三种方法注释甲基化探针 

例如做450的Manifest,包含了从beedchip到最终的文件的对应号，但有部分信息要提前过滤掉，如一开头的Header，结尾的control probe. 可从illumina官网直接下载对应的注释文件，把Header,control probe,SNP删除后行数刚好485512。

芯片甲基化探针数量相对人类蛋白编码基因太大，而我们最关心的是如何确定基因的启动子区域甲基化水平，怎么做呢?

1.定义一个基因的启动子

2.确定该基因的启动子区域的多个甲基化的探针信号值的统计指标

一般分析流程（类似mRNA芯片表达矩阵）：

1.甲基化数据的下载（主要从GEO和TCGA下载，可用GEOquery从GEO中甲直接下载基化矩阵集，另外可用，用Minfi或CHAM下载原始文件.IDAT后处理。

2.数据整理，探针注释，重点在于质量控制

3.差异甲基化，三个层次的甲基化

4.热图，火山图，主成分分析图

5.功能集注释分析

6.批量位点甲基化和和表达相关性分析

7.批量生存分析