蛋白酶K
蛋白酶K是一种重要的酶类分子，在生物学和医学领域中发挥着关键作用。它能够特异性地降解蛋白质，参与多个细胞过程，并在许多疾病治疗中具有潜在应用价值。本文将介绍蛋白酶K的结构、功能以及其在生命科学和医药领域中的应用。
1、蛋白酶K的结构与功能
结构：蛋白酶K属于半胱氨酸类囊泡形成家族（cysteine protease family），由单个多肽链组成。其活性部位含有一个嵌入式半胱氨酸残基，通过此残基对目标蛋白质进行切割。
功能：作为一种内源性的溶菌素，蛋白酶K主要参与细胞内外废旧或异常突变、受损或不再需要的蛋白质分子降解过程。该过程被称为自噬（autophagy）或真核生物中的肾小管上皮细胞中被称为溶菌作用（lysosomal activity）。蛋白酶K通过降解内源性和外源性蛋白质，调控细胞代谢、生长、分化以及应激响应等重要过程。
2、蛋白酶K在生命科学领域的应用
蛋白质降解研究：由于其特异性和高效性，蛋白酶K广泛应用于研究不同生物过程中目标蛋白质的稳定性与功能。例如，在信号转导途径研究中，可以使用蛋白酶K来选择地去除或切割特定调节因子，从而揭示其对信号传输的影响。
自噬研究：自噬是一种重要的细胞自我修复机制，在许多生理和病理状态下发挥着关键作用。通过使用蛋白酶K抑制剂或基因敲除技术，可以进一步了解自噬通路，并阐明它在健康和疾病中的作用机制。
3、蛋白酶K在医药领域的应用
肿瘤治疗：蛋白酶K在肿瘤治疗中具有巨大潜力。它可以针对抑制细胞凋亡和促进恶性转化的关键因子进行特异性降解，从而抑制肿瘤生长和扩散。
神经退行性疾病治疗：蛋白酶K在神经退行性疾病（如阿尔茨海默氏、帕金森等）的治疗中也显示出了潜在价值。通过调节异常聚集的蛋白质形成，蛋白酶K能够减轻神经毒性并改善神经功能。
蛋白酶K的配制标准及保存方法
蛋白酶K广泛应用于分子生物学,药理学等科研方面.一种非特异性、枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶,具有很高的比活性.一般储存在-20°C,避光防潮密闭干燥。
蛋白酶Ｋ主要应用于基因检测中基因抽取，是检测试剂盒生产的重要原料，蛋白酶K产品由于在尿素和SDS中仍然具有降解天然蛋白质的能力，因而被广泛应用于制备脉冲电泳的染色体DNA，以及去除DNA和RNA中的核酸酶。现有基因抽提及检测试剂盒中均需配备该酶。
蛋白酶K配制标准：20mg/ml蛋白酶K配制标准(proteinaseK)：将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K*溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。
蛋白酶K的保存：保存在-20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。
蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理，它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时，都会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织切片的脱落，细胞核的消失，从而影响杂交结果。EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用，解决上述出现的问题，并能达到理想的染色效果。
蛋白酶K具有广泛的底物特异性
蛋白酶K具有广泛的底物特异性。即便存在洗涤剂的情况下，其仍可降解许多非变性状态的蛋白质。蛋白酶K分离自一种可在角质上生长的真菌白色侧齿霉菌(Engyodontiumalbum)（前称腐生真菌(Tritirachiumalbum)。因此，蛋白酶K能够降解非变性状态的角质（头发），因而称为“蛋白酶K”。1其切割的主要位点为带有封闭氨基基团、邻近脂族或芳香族氨基酸羧基端的肽键。因其广泛的特异性，其较为常用。
蛋白酶K（ProteinaseK），相对分子量约为29.3kDa,是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。可切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，应用广泛，可用于制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶等实验，蛋白酶K的一般工作浓度是50—100µg/ml。因蛋白酶K在变性剂如SDS（1%）中可提高其活性，所以在使用中，常根据所用缓冲液是否含有SDS、尿素、pH、温度等因素确定具体的工作浓度。蛋白酶K在较广的pH范围内（pH4-12.5）均有活性。
蛋白酶K有两个Ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染核酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶k消化过程中通常也加入EDTA（以抑制依赖于mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶k具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/lCa2+而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至终浓度为2mmol/l，以鳌合Ca2+。
