杂志：2025年3月《World Journal of Oncology》
题目：酪氨酸激酶抑制剂耐药基因 ZW10 在肝细胞癌中的综合研究
单位： 广西医科大学第一附属医院
1 背景知识：抗体疗法与 TKI 的作用机制差异
TKI（Tyrosine kinase inhibitors）：通过与酪氨酸激酶的 ATP 结合位点结合，抑制其酶活性，从而影响细胞信号传导
抗体：主要通过与特定的受体（如EGFR、HER2等）结合，阻断受体激活，或者通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）或补体依赖性细胞毒作用（CDC）或则直接抗体-药物偶联物（ADC）的化疗药等机制来消灭靶细胞
2 Summary
1、酪氨酸激酶抑制剂（TKI）是肝细胞癌（HCC）的一线治疗药物，但耐药性限制了其长期临床疗效。本研究旨在探讨 TKI 耐药基因ZW10（ZW10）在 HCC 中的表达模式及其可能的临床意义
2、全基因组 CRISPR 敲除文库中 ZW10 基因对应的小向导 RNA（sgRNA）丰度降低（LogFC = -1.19），提示 ZW10 可能参与 TKI 耐药的发生发展
3、ZW10 在包括 HCC 在内的多种恶性肿瘤中均存在差异表达，且 HCC 与患者预后较差相关
4、ZW10 mRNA表达的合并标准化均数差（SMD）为0.47（95%置信区间（CI）：0.32～0.63），SROC下面积为0.76（95%CI：0.72～0.79），灵敏度为0.63（95%CI：0.53～0.72），特异度为0.77（95%CI：0.67～0.84）
5、ZW10 对 HCC 细胞的生长具有重要意义，其可能参与核质转运途径
6、高水平的 ZW10 与 TKI 疗效及免疫细胞浸润丰富度呈负相关
7、预测莫西替司他和卡培他滨是潜在的 ZW10 抑制剂，其最小结合能分别为 -8.2 和 -7.1 kcal/mol
8、ZW10 被认为是一种 TKI 耐药和肿瘤支持基因，也是 HCC 有希望的新型预后生物标志物或克服 TKI 耐药的治疗靶点
3 结果
3.1 CRISPR 阴性和阳性筛选
1、构建全基因组 CRISPR/Cas9 敲除文库，慢病毒感染的 HCC 细胞系 Huh7 ，用江苏正大天晴公司生产的 TKI 药物 安罗替尼 处理 21 天。MAGeCK 算法进行质量评估和基因表达谱分析，基于阴性筛选策略，将 sgRNA 丰度较低的基因视为 TKI 耐药基因
2、TKI 治疗组基因谱中 ZW10 对应的sgRNA丰度降低（LogFC = -1.19，P = 0.01），提示 ZW10 缺陷的 HCC 细胞对 TKI 更敏感，更容易死亡，如 Fig1
3.2 ZW10在各种恶性肿瘤中的表达情况
1、Fig2a，ZW10 mRNA 水平在各类癌种的表达量(from TCGA)。LIHC - 肝细胞癌（Liver hepatocellular carcinoma）
2、Fig2b，ZW10 蛋白水平在各类癌种的表达量(from UALCAN , THPA)
3、Fig2b，ZW10 免疫组化水平，ZW10 蛋白位于细胞质中，与正常组织相比，HCC 组织中的细胞核增大，染色密度更高
4、Fig3a，根据单因素 Cox 回归分析结果，ZW10 在各类癌种的生存期
单因素 Cox 回归：Cox回归分析会评估单一变量（如年龄、性别、治疗方案等）对总生存期的影响。HR（风险比，Hazard Ratio）值越大，表示该因素越可能加速患者的死亡。HR > 1：表示该因素会增加患病或死亡的风险。HR < 1：表示该因素会降低患病或死亡的风险。例如，HR 为 1.5 表示该因素将使风险增加 50%
3.3 ZW10 表达及鉴别功效（这里是 meta 分析的内容）
2、Fig4a , 共纳入 38 个数据集，进行了森林图分析，HCC 组中 ZW10 基因的表达量明显升高 （SMD = 0.47，95％CI：0.32 - 0.63）
3、Fig4b , ZW10 鉴别HCC的灵敏度和特异度分别为0.63（95% CI：0.53～0.72）和0.77（95% CI：0.67～0.84)
4、Fig4c , 纳入的数据无明显发表偏倚（P=0.115）。以上的结果均显示 HCC 组织中 ZW10 表达上调
3.4 预后价值
1、Table1 ,ZW10基因高表达者HCC死亡风险增高（HR=1.05，95%CI：1.02～1.07，P<0.01）
2、AJCC III～IV期患者 ZW10 表达水平较I～II期患者增高（P<0.01，Fig6e ），且死亡风险增高（HR=2.45，95%CI：1.67～3.58，P<0.01，Table1）。与确诊为pT1+pT2期的患者相比，确诊为pT3+pT4期的患者ZW10表达水平升高（P < 0.01，Fig6d ），且存在死亡风险（HR = 2.47，95% CI：1.68 - 3.61，P < 0.01，Table1）
3、ZW10高水平组与HCC患者总生存时间相关（两阶段检验，P < 0.01， Fig6f）
3.5 生物学功能
1、DepMap团队利用全基因组RNAi或CRISPR敲除技术，分析不同基因敲除对癌细胞系生长的影响。本研究下载了“CRISPR (DepMap 22Q2 Public+Score Chronos)”数据，提取了ZW10基因缺陷对20个HCC细胞系的基因效应值，并通过散点图进行可视化。基因效应值小于0表示基因敲除的效果是抑制细胞活力
2、Fig7 , ZW10敲除对20株HCC细胞株（PLCPRF5、JHH7、SNU886、HLF、SNU449、SNU475、SKHEP1、JHH6、SNU398、JHH5、HEPG2、JHH1、SNU423、SNU182、HUH7、SNU387、JHH4、HUH1、SNU761、JHH2）的基因效应评分均小于0，表明 ZW10 缺陷可抑制 HCC 细胞的生长(这里应该是使用了所有细胞系的数据，只是把HCC的数据用红点进行了标注 )
3.6 不同 ZW10 表达下 TKI 的敏感性
1、为了全面了解 ZW10 对多种 TKI 药物耐药的潜在贡献，作者利用 “pRRophetic” 软件包探索了 ZW10 转录水平与各种TKI成分的半数抑制浓度（IC50）之间的关系。基于LIHC-TCGA数据集，采用每百万转录本数（TPM）方法对ZW10测序数据进行标准化。根据ZW10转录水平的平均值，将样本分为ZW10高水平组和ZW10低水平组，并使用独立样本 t 检验和 Pearson 分析探讨 ZW10 与 TKI 药物疗效之间的关系
2、研究预测了 371 例 HCC 样本（其中 ZW10 高表达组 157 例，ZW10 低表达组 214 例）对 10 种 TKI 药物的敏感性。与 ZW10 低表达组相比，ZW10 高表达组对阿昔替尼、博舒替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、舒尼替尼的IC50值较高（P < 0.05，Fig8a-e）
3、ZW10的转录表达与阿昔替尼 (r = 0.21, P < 0.01)、博舒替尼 (r = 0.21, P < 0.01)、拉帕替尼 (r = 0.20, P < 0.01) 和舒尼替尼 (r = 0.17, P < 0.01) 的 IC50 值呈正相关，表明ZW10表达的增加与 TKI 反应率的降低相关
3.7 通路富集分析
1、使用 limma 包计算371例 HCC 组织与50例非 HCC 组织相比的差异上调基因，以 logFC> 1 为参考标准。其次，计算 ZW10 基因表达与其他基因表达的 Pearson 相关系数，将Pearson相关系数大于 0.75 且P值小于 0.05 的基因认定为 ZW10 的强正相关基因。将差异上调基因与 ZW10 强正相关基因的交叉基因输入 DAVID 数据库进行生物学机制分析
2、Fig9 , 42个ZW10差异基因和强相关基因在生物过程的核质运输途径，细胞成分的核质、动粒、核膜和核孔途径，以及分子功能的蛋白质结合途径中均有显著富集。核质运输途径是KEGG分析中唯一富集的机制
3.8 肝细胞癌微环境特征（其实用单细胞数据更直接）
1、xCell 是一个基于基因表达队列，通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）预测单个样本中免疫细胞丰度的工具，可以预测 64 种细胞类型，包括先天性和适应性免疫相关细胞、造血祖细胞、上皮细胞和分泌各种因子来调节肿瘤微环境的基质细胞。本研究利用 xCell 包对 371 例肝细胞癌样本的肿瘤微环境特征进行了估算，并用 Wilcoxon 检验比较了不同 ZW10 表达水平下肿瘤微环境特征的差异，并用 Spearman 方法探讨了 ZW10 表达水平与肿瘤微环境细胞之间的相关性
3.9 筛选对抗 ZW10 蛋白的化合物（涉及小分子药计算筛选，药物分子与蛋白的 dock）
4 参考文献
[1] Huang QL, Zhang GL, Su QY, Chi BT, Lin Q, Li S, He H, Tang YL, Dang YW, Chen G, He RQ. Comprehensive Investigation of a Tyrosine Kinase Inhibitor-Resistant Gene Zeste White 10 in Hepatocellular Carcinoma. World J Oncol. 2025 Apr;16(2):210-226. doi: 10.14740/wjon2514. Epub 2025 Mar 9. PMID: 40162104; PMCID: PMC11954606.
