Cancer Cell | 高分辨单细胞图谱揭示非小细胞肺癌中性粒细胞多样性和可塑性

原创 huacishu 图灵基因 2022-11-24 10:11 发表于江苏

收录于合集#前沿生物大数据分析

撰文：huacishu

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亮点：

1、作者通过整合来自556个样本和318名患者的1283972个单细胞，来高分辨率解剖NSCLC肿瘤微环境；

2、作者将患者分为免疫缺失型、B细胞型、T细胞型和髓细胞型。使用具有基因组和临床信息的大量样本，鉴定了与肿瘤组织学和基因型相关的细胞成分；

3、作者作者重点分析组织驻留中性粒细胞（TRN），并发现在组织微环境中获得新功能特性的不同亚群，为TRN的可塑性提供证据；

4、作者发现TRN衍生的基因签名与抗程序性细胞死亡配体1（PD-L1）治疗失败有关。

奥地利因斯布鲁克医科大学Zlatko Trajanoski教授课题组在国际知名期刊Cancer Cell在线发表题为“High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer”的论文。非小细胞肺癌（NSCLC）具有分子异质性和不同的免疫细胞浸润模式，这与治疗敏感性和耐药性有关。然而，人们对免疫细胞表型在不同患者亚群中的变化缺乏充分了解。

本文作者通过整合来自556个样本和318名患者的1283972个单细胞，来高分辨率解剖NSCLC肿瘤微环境。作者将患者分为免疫缺失型、B细胞型、T细胞型和髓细胞型。使用具有基因组和临床信息的大量样本，鉴定了与肿瘤组织学和基因型相关的细胞成分。然后，作者重点分析组织驻留中性粒细胞（TRN），并发现在组织微环境中获得新功能特性的不同亚群，为TRN的可塑性提供证据。最后，作者发现TRN衍生的基因签名与抗程序性细胞死亡配体1（PD-L1）治疗失败有关。

非小细胞肺癌（NSCLC）是一种高度侵袭性和异质性的疾病，具有不同的组织学亚型和不同的突变特征。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步使得能够在不同阶段对复杂的NSCLC肿瘤微环境（TME）进行剖析。然而，这些研究的一个主要限制是每个研究分析的患者样本数量有限。此外，由于缺乏基因组数据以及长期随访数据，无法全面分析生物异质性及其对治疗抵抗和生存结果的潜在贡献。

中性粒细胞是促肿瘤和抗肿瘤炎症途径的重要介质，包括中性粒细胞限制淋巴细胞向恶性肿瘤的转运，从而限制程序性细胞死亡1（PD-1）抑制的效力。非小细胞肺癌患者的相关研究已将中性粒细胞与淋巴细胞比率与临床结果和免疫治疗反应联系起来。此外，临床前证据强烈支持使用中性粒细胞耗竭剂（如CXCR2拮抗剂）作为免疫检查点抑制剂的佐剂。

为了克服上述障碍，作者将主要的公开可用数据集汇编成一个综合的NSCLC scRNA-seq图谱，涵盖232名NSCLC患者和86名非癌症对照。此外，考虑到中性粒细胞单细胞数据的稀缺性，通过分析17名NSCLC患者的样本来补充图谱，使用一个平台捕获具有非常低转录物计数的细胞，并对组织驻留中性粒细胞（TRN）进行深入表征，包括肿瘤相关中性粒细胞和正常相邻组织相关中性粒粒细胞。

核心大规模NSCLC单细胞图谱的生成

作者首先通过汇编19项研究的scRNA-seq数据和21个数据集（包括298名患者的505个样本），开发了核心NSCLC图谱（图1A）。总体而言，核心图谱整合了898422个单细胞，基于先前建立的典型单细胞特征，包括169223个上皮细胞、670409个免疫细胞和58790个基质细胞和内皮细胞，将其注释为12个细胞类型标识和44个主要细胞亚型或细胞状态（例如分裂细胞）（图1B）。

先前的scRNA-seq研究区分了肺鳞癌（LUSC）和肺腺癌（LUAD）的临床相关类型。UKIM-V数据集由常规病理学家进行组织病理学分类，然后由肺部病理学家进行独立审查。图谱中的癌细胞显示其转录组谱的高度异质性（图1B）。由于患者队列庞大，能够根据其特定标记基因表达特征应用高分辨率肺癌细胞分类。

作者划分了以下主要集群LUSC（KRT5、KRT6A、KRT17、SOX2、NTRK2、TP63）；LUAD（CD24、MUC1、KRT7、NAPSA、NKX2-1、MSLN）；具有上皮到间质转化（LUAD EMT）迹象的LUAD（VIM、SERPINE1、CDH1、MIF）；具有神经内分泌特征的LUAD（LUAD NE）（CHGA、SYP、NCAM1、TUBA1A）；与EMT和转移（LUAD MSLN）相关的间皮素（MSLN）高表达的LUAD；以及表达LUAD和LUSC标记物的NSCLC（MUC1、KRT7、KRT6A、SOX2）（图1B）。

在大多数scRNA-seq研究中，中性粒细胞的代表性不足

在所有核心图谱样本的肿瘤和正常肺组织中，中性粒细胞簇（FCGR3B、CSF3R、CXCR2和G0S2）包含8468个mRNA计数明显较低的细胞。值得注意的是，78%的图集中性粒细胞来自UKIM-V数据集（图1C），其中中性粒细胞分别占所有细胞的12%和所有白细胞的18%。因此，中性粒细胞在用BD Rhapsody生成的UKIM-V数据集中是一个主要的细胞簇，在用10x Chromium生成的数据集中无法适当检测到低mRNA含量的中性粒细胞簇，并且在应用其他平台时仅在非常有限的范围内才能检测到（图1C）。

低mRNA含量细胞的scRNA-seq

由于中性粒细胞的高度临床相关性以及对其更好的深入转录组特征的需要，作者利用BD Rhapsody平台在描绘低mRNA含量细胞方面的优势进行进一步分析。UKIM-V数据集包含122902个细胞，这些细胞聚集成由特定标记基因表达定义的所有主要肺细胞类型（图1D）。中性粒细胞的特征是具有异常低的mRNA含量的细胞簇，因此检测到的转录物数量相对较少，但由于每个细胞捕获的mRNA分子数量相对较高，可以很容易地描述这些细胞。

通过迁移学习扩展核心单细胞图谱

为了将核心图谱的强度与作者自己的数据（包括中性粒细胞）相结合，作者使用了最近开发的转移学习方法scArches，该方法能够使用额外的当前和未来数据集扩展核心图谱。将第二个UKIM-V数据集以及一个最近发布的包含288157个细胞的数据集映射到图谱上（图1E）。该扩展图谱现在整合了19项研究的29个数据集，包括1283972个细胞、44种细胞类型、556个样本和318名患者，产生17.5亿个表达值。

当将原发性肿瘤组织中的LUSC和LUAD中的细胞组成与作为参考细胞类型的癌细胞进行比较时，作者发现LUSC中的中性粒细胞比例显著较高，而LUAD中巨噬细胞、CD4+T细胞更丰富（图1F）。与晚期NSCLC肿瘤相比，早期的细胞类型组成分析显示早期cDC2的丰度更高。为了验证这一发现，对110名NSCLC患者（55名LUAD和55名LUSC）进行了正交验证，并对中性粒细胞、CD4+T细胞和巨噬细胞进行了免疫组织化学染色。结果证实了这些发现（图1G），并进一步支持组织学特异性TME特征。

TME的单细胞组成显示出不同的NSCLC肿瘤免疫表型

接下来，使用扩展图谱根据TME的浸润模式对NSCLC患者进行分层。批量校正细胞类型组分的无监督聚类显示了四种不同的肿瘤免疫表型（图2A）：（1）免疫缺失（ID）肿瘤（即，没有显著的免疫细胞浸润，但癌细胞组分较高）；（2） 具有B细胞优势的肿瘤亚型（B；B细胞、浆细胞、肥大细胞）；（3） 具有髓系优势的肿瘤亚型（M；巨噬细胞/单核细胞）；和（4）具有T细胞优势的肿瘤亚型（T；CD8+、CD4+、T调节细胞）。

为了鉴定基于肿瘤细胞的TME印迹特征，接下来分析了四种免疫表型中每一种的癌细胞中差异富集的途径。ID亚型显示雄激素途径显著下调（图2B）。对每个亚型的癌细胞中差异表达的转录因子的分析表明，ID亚型中FOXO4显著下调。如前所述，FOXO转录因子是免疫细胞稳态的重要介质，因此FOXO4下调可促进ID表型。

然后，应用工具CytoSig来定义每种免疫表型的癌细胞中富集的细胞因子信号特征（图2C）。作者发现髓系亚群中I–III型干扰素信号显著上调，表明巨噬细胞/单核细胞在TME中的干扰素信号传导中起着特别重要的作用（图2C）。

细胞间通信分析揭示了TME中的异质细胞串扰

使用CellPhoneDB配体-受体复合物数据库，接下来通过分析前10个差异表达的癌细胞配体（图3A），评估了两种主要组织类型LUAD和LUSC中癌细胞对不同免疫细胞的串扰的差异。在两种组织学中，癌细胞相互作用都指向具有不同靶点的不同免疫细胞亚型。

在LUAD中，发现从癌细胞到中性粒细胞、巨噬细胞/单核细胞、肥大细胞和经典树突状细胞（cDC）的KDR-VEGFA轴显著上调，这可能与该组织类型中癌细胞的免疫抑制信号有关。相反，在LUSC癌细胞中，存在SPP1信号的上调以及Jagged1（JAG1）的上调，其诱导NOTCH，从而通过例如中性粒细胞募集促进肿瘤进展并调节肿瘤免疫微环境。

接下来，通过分析差异表达的癌细胞配体，研究了患者免疫亚型T细胞、B细胞、髓细胞和ID中癌细胞与免疫细胞的串扰（图3B）。虽然在ID亚群中表达下调，但B、M和较少的T细胞亚群显示几种趋化因子（CXCL9/10/11、CCL3/13/18）向T和髓细胞亚群上的同源受体的信号转导上调，这表明癌细胞分泌的趋化因子梯度有助于免疫浸润。

大量RNA-seq数据的整合揭示了基因型免疫表型的关联

在之前的研究中，作者已经表明，包括突变负荷、肿瘤异质性和特定驱动基因在内的基因组特征决定了免疫表型。在这里，单细胞NSCLC图谱的高分辨率使得能够对这些决定因素进行深入分析。EGFR、TP53、KRAS和STK11突变显示出明显的免疫浸润（图4A–4D）。相反，TP53和STK11突变基因型与CD8+T浸润相关，这在EGFR或KRAS突变肿瘤中不可见（图4C、4D）。因此，作者对TME的单细胞观察为肿瘤的遗传组成、组织学和各自的免疫环境之间的联系提供了进一步的证据。

接下来，分析了TCGA队列中1026名患者的细胞类型转录组特征及其与生存率的关系。富含B细胞肿瘤的NSCLC患者与生存率的提高有显著关联，而中性粒细胞是最强的负生存预测因子（图4E），与单核细胞一起，是LUAD和LUSC中唯一的负预测因子免疫细胞类型（图4E）。使用一种基于使用大量RNA-seq数据去卷积的独立方法，证实了B细胞确实与更好的预后相关（图4F）。最后，对CD8+T细胞亚型的分析表明，CD8+T淋巴细胞是提高生存率的最强预测因子（图4G）。

TRN在TME中获得新属性

TANs是一种非常异质的细胞群体，具有抗肿瘤和促肿瘤特性。可能是由于技术原因，NAN的特性比TAN的特性更为滞后。为了克服这种不充分的TRN表征，在此使用扩展图谱表征了NSCLC中TAN和NAN的转录组特征（图5A和5B）。

与LUAD患者相比，LUSC患者的中性粒细胞更丰富，通过流式细胞术分析（图5C）和免疫组化在两个外部队列中证实了这一点（图1G）。总体TAN表型以OLR1（LOX-1）、VEGFA、CD83、ICAM1和CXCR4的高表达和CXCR1、CXCR2、PTGS2、SELL（CD62L）、CSF3R和FCGR3B（CD16B）的低表达为特征（图5D）。

中性粒细胞通过释放VEGF和其他促血管生成因子支持癌症中促血管生成的转换。作者的图谱提供了中性粒细胞是NSCLC TME中VEGFA表达的主要来源的证据（图5E）。主要关注的高度差异表达的TAN标志物是由OLR1基因编码的凝集素型氧化LDL受体1（LOX-1），该基因被称为氧化低密度脂蛋白（LDL）的主要受体（图5D）。

此外，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）（OLR1的核受体和直接转录调节因子）在TAN中升高（图5F）。对NSCLC患者组织的流式细胞术分析证实了TAN中LOX-1（OLR1）的表达升高（图5G）。对石蜡包埋的NSCLC肿瘤组织和患者匹配的正常相邻肺组织进行了多重免疫荧光染色。LOX-1和CXCR2的共染色表明LOX-1是中性粒细胞标记物。作者发现LOX-1+细胞在肿瘤组织中浸润，但在相邻的正常肺组织中没有浸润（图5H），这突出了该标记物的癌组织特异性。

TRN的可塑性和非规范功能性质

在所有图集中性粒细胞（n=19166）上应用了无监督聚类，分离了四个TAN亚群（TAN-1至TAN-4）和三个NAN亚集（NAN-1至NAN-3）（图6A）。标记基因选择揭示了簇之间广泛的表型异质性，并允许识别每个亚簇的标记基因。

特定的NAN-1基因包括S100A12（一种已知的促炎中性粒细胞活化标志物）、NETosis共因子PADI4以及促血管生成标志物（PROK2、MMP9）。NAN-2簇与NAN-1簇非常相似，但显示一些NAN-1特异性基因（例如S100A12、PADI4、MMP9）的表达减少。NAN-3显示干扰素刺激基因（GBP1、GBP5、IFIT2）的强表达（图6B）。

为了验证scRNA-seq结果，使用流式细胞术分析了另外11名患者的样本，证实了抗原呈递表型，与正常相邻肺组织的中性粒细胞相比，NSCLC中TAN上的HLA-DR上调（图6C）。

中性粒细胞亚群的转录谱表明其显著的表型可塑性。因此，仅使用UKIM-V数据集进行RNA速度分析，因为该方法需要原始测序数据。分析表明从NAN-3向NAN-2和NAN-1（其转录组特征相似）的转变。NAN-3和NAN-2分别转变为TAN-2和TAN-1，TAN-1和TAN-2转变为所有TAN亚型（图6D和6E）。

接下来，通过分析每个亚群的差异表达的TRN配体，研究了TRN亚群与CD8+T细胞和癌细胞的细胞相互作用，揭示了NAN与TAN的不同信号（图6F）。在所有TAN亚群中，发现VEGFA向癌细胞发出信号，再次强调了其重要的促血管生成作用，以及SPP1信号，这与免疫抑制TME和促迁移效应相关。

TRN基因签名与免疫检查点抑制剂治疗失败相关

在单细胞水平上对TRN多样性的去卷积促使作者将这些信息与患者预后以及对化疗和免疫检查点抑制剂（ICIs）治疗的反应联系起来。使用先前提出的从大量RNA-seq样本中寻找用于细胞类型估计的特异性标记基因的方法，导出了对TAN或NAN高度特异性且仅在其他细胞中以非常低的水平表达的基因的标记（图6G）。作者还将TRN标记定义为TAN和NAN标记基因的结合。TRN标记基因在不同TRN亚群之间的表达是异质的（图6H）。

为了分析TRN特征的预后和预测价值，作者使用了来自POPLAR和OAK治疗前肿瘤的大量RNA-seq数据，这是两项针对NSCLC患者的抗PD-L1抗体和化疗的随机临床试验。。在这些NSCLC队列中，TRN基因签名与抗PD-L1治疗失败相关（图6I）。对这些队列的生存数据的分析表明，TRN标记对抗PD-L1组的预后益处显著（图6J）。

讨论

作者通过整合超过1280000个细胞的29个数据集，构建了NSCLC单细胞转录组的大规模图谱。利用NSCLC图谱的信息内容，使用适合于描绘低mRNA含量细胞的平台对额外的患者样本进行测序，这使我们能够全面表征TRN的多样性和可塑性。

总之，作者提供了一个具有单细胞分辨率的NSCLC图谱以及一个能够对数据集进行交互探索的门户网站(https://luca.icbi.at)。在这里提出的生物学见解以及利用高分辨率NSCLC图谱所产生的未来发现，可以为对免疫检查点阻断剂反应不足的NSCLC患者开发联合疗法提供基础。

教授介绍

Zlatko Trajanoski是奥地利因斯布鲁克医科大学生物中心生物信息学研究所的教授。他的实验室的研究重点是使用计算方法破译肿瘤与免疫细胞的相互作用，并开发精确免疫肿瘤学的分析工具。他的工作有助于阐明适应性免疫系统在人类结直肠癌中的作用，并为患者分层开发了一种新的免疫评分。他最近的工作重点是使用实验/计算方法联合鉴定结直肠癌免疫治疗的内在和获得性耐药机制。

参考文献

Salcher S, Sturm G, Horvath L, et al. High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 2022;S1535-6108(22)00499-8. doi:10.1016/j.ccell.2022.10.008