454测序是第一个出来的二代测序，但是现在没人用了，因为数据处理太复杂，而且由于不是很普及，所以大家都没有心情去开发软件，现在的都是老版的软件了，说不定还有兼容性的问题。
现在用的最普遍的就是illumina的了
有很多型号
Miniseq Myseq
Nextseq500这个比较不错
高通量的可以上hiseq2500
如果是产业性的就来个Hiseq3000/4000 最牛逼的是X 10 这个一般的实验室和基础设施都是玩不转的，这么高的通量一般都要国家基础设施类型的使用
PacBio现在很火
其中的核心技术叫做 零基波导，名字倒是牛逼哄哄的挺唬人。
subread就是一条序列被测了好几次
CCS需要聚合酶来回测同一条序列，得到至少两个subread，才能形成CCS
CCS可以提高准确性，比单个align回基因组的错误率小很多
怎样计算基因组覆盖度
C= 总测序碱基数/基因组的碱基数
QC
这个怎么说呢，如果测序数据本身烂，再怎么QC也救不回来。QC只做最基本的，不要花时间在QC上折腾，没啥用，还白费劲。不要对本身就不错的数据过分的矫正，矫正过程本身就引入新的错误信息
trim
靠谱的程序有
bbduk trimmomatic flexbar cutadpt
illumina的
# TruSeq Indexed Adapter
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
前面还可以加个A
告诉Fastqc去检测哪一个adaptor , 到fastqc的安装目录下找到 configuration文件夹
可以写好adaptor的fasta文件，然后在trim adaptor里面引用
用trimmomatic 的时候命令顺序比较重要
trimmomatic PE SRR519926_1.fastq SRR519926_2.fastq trimmed_1.fq unpaired_1.fq trimmed_2.fq unpaired_2.fq SLIDINGWINDOW:4:30 TRAILING:30 ILLUMINACLIP:adapter.fa:2:30:5
一般来说，如果是重测序，也就是基因组信息已知的情况下，不需要去先去adaptor
但是如果拼接基因组的情况下，就需要去adpator了
序列的重复冗余
这个是很重要的
来源： 1 基因组里面本来就有很多重复序列 2 PCR的重复序列
咋找到这些重复序列？两条路
1 序列完全一样的
2 align到同一个位置上的
但是这个得很小心的去做，因为有风险在里面，就是说测序特别准的重复序列会被干掉，但是出现测序错误的重复序列因为不能彼此匹配从而留了下来，这就导致了我们反而在数据中对测序错误进行了富集，这是给自己找事啊
现在出了一个新套路，就是先分析序列中的K mer ， 然后根据k mer去重复
序列的重复冗余不好的地方就是，在call variant的时候
因为每个variant的打分是根据他们出现的次数来的，所以一旦有一条PCR 的duplicate，就多打了一分，但是这个分是靠PCR骗来的，导致某一个比较罕见variant显得很重要的高频一样
在FASTQC的duplicate的报告中
在最顶上的那个数字最重要，这里面说的是整一个数据集中不重复的序列占多大比例
怎么找出重复序列
在进行到bam文件之后用picard markduplicates 来标记重复序列
怎样把PE的reads搞成一个长reads
用FLASH
bbmerge
可以用bbrename重命名每一条reads
AfterQC也是个不错的工具，但是得用python2.7
进行错误矫正：
这个牛逼的功能也是刚接触，还可以这么玩
bb套装中有个tadpole.sh 可以直接的进行错误的矫正
tadpole.sh in=SRR519926_1.fastq out=tadpole.fq mode=correct out=r1.fq out2=r2.fq overwrite=true
这个bb真是个牛人，认识一下，Brian Bushnell ， 套装的开发者，膜拜
